劉洪博 張清泉 杜紅麗 侯素平 李 聰

子宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于乳腺癌。研究認(rèn)為，在一些發(fā)展中國家和地區(qū)子宮頸癌5年生存率為20%～40%[1]。在對中晚期子宮頸癌患者化療中，鉑類藥物不論是在單藥還是聯(lián)合治療方面，應(yīng)用均相當(dāng)廣泛且均具有絕對優(yōu)勢[2]。癌細(xì)胞產(chǎn)生抗藥性和腎臟毒性是導(dǎo)致子宮頸癌患者治療失敗的主要原因之一，而人類銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 1（human copper transporter 1,hCTR1）可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中順鉑（cisplatin,cDDP）的含量。本研究旨在應(yīng)用組織芯片技術(shù)探討hCTR1在子宮頸鱗癌中的表達(dá)情況及輔助治療作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2009年6月—2011年5月于河北省人民醫(yī)院和哈勵(lì)遜國際和平醫(yī)院婦科門診活檢、錐切或住院手術(shù)患者的子宮頸組織標(biāo)本共189例，患者年齡27～59歲，中位年齡46.7歲。子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組52例，其中子宮頸鱗癌原發(fā)組40例，除3例術(shù)前進(jìn)行放療外，其余術(shù)前均未進(jìn)行放化療；復(fù)發(fā)組12例，第2次手術(shù)前均進(jìn)行了3～8個(gè)療程的放化療。宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變（CIN）106例，其中CINⅠ組34例，CINⅡ～Ⅲ組72例。正常宮頸組31例，取自同期子宮良性病變行子宮切除術(shù)的宮頸。各組標(biāo)本均由2位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師對所有切片進(jìn)行復(fù)查。同時(shí)收集患者臨床病理資料包括腫瘤大小、組織學(xué)分級按照《外科病理學(xué)》第2版的標(biāo)準(zhǔn)、臨床分期參照2008年FIGURE O/IGCS婦科惡性腫瘤分期及臨床實(shí)踐指南、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等。

1.2 方法

1.2.1 組織芯片的制作 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，共設(shè)計(jì)為8×8點(diǎn)陣組織芯片3張。自制組織取樣器和受體蠟?zāi)?，制備取樣與組織蠟芯后進(jìn)行切片及裱片，完成組織芯片制作，見圖1。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色（IHC） hCTR1兔抗多克隆抗體購自英國NOVUS生物技術(shù)公司；即用型SP通用試劑盒 （SP-9001）和DAB顯色劑均購自北京中杉生物技術(shù)公司。應(yīng)用SP法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，其中3張切片作hCTR1免疫組化染色，均設(shè)立陽性對照和陰性對照，用預(yù)實(shí)驗(yàn)中已知的陽性組織切片作為陽性對照；用0.1 mol/L PBS代替一抗，作為陰性對照。

1.3 結(jié)果判定 （1）組織芯片染色結(jié)果判定。組織芯片中研究樣本充足的位點(diǎn)為有效患者；因供體組織太少或缺失，判斷為無效或無意義患者，該患者在研究樣本中剔除。（2）免疫組織化學(xué)結(jié)果判定。參照文獻(xiàn)[3]，hCTR1定位于細(xì)胞質(zhì)或（和）細(xì)胞膜，對組織芯片上每個(gè)位點(diǎn)的免疫組化染色進(jìn)行評價(jià)，隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野（×200）下綜合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行半定量測定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或確切概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織芯片及HE染色質(zhì)量評價(jià) 制備完成的組織芯片蠟塊完整，切片組織點(diǎn)陣排列整齊，定位明確；組織芯片各有意義位點(diǎn)的病變組織結(jié)構(gòu)完整，見圖2。正常宮頸組31例中鏡下有意義組織23例；CINⅠ組34例中有意義者27例；CINⅡ～Ⅲ 組72例，有意義者67例；子宮頸鱗癌組52例，均為有意義組織。

2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 31例正常宮頸鱗狀上皮hCTR1表達(dá)較低，僅在基底層一些細(xì)胞中表達(dá)，見圖3。CIN組及子宮頸癌組患者h(yuǎn)CTR1陽性表達(dá)顯著增加，見圖4～6。CINⅡ～Ⅲ組較正常宮頸組及CINⅠ組中hCTR1的陽性表達(dá)增加 （P<0.01），宮頸鱗癌組較正常宮頸組及CINⅠ組中hCTR1表達(dá)增加（P<0.01），但CINⅠ組與正常宮頸組，CINⅡ～Ⅲ組與宮頸鱗癌組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。

Table 1 The protein expression of hCTR1 in various lesions of cervical squamous epithelium表1 不同級別宮頸組織中hCTR1蛋白的表達(dá) 例（%）

2.3 hCTR1蛋白表達(dá)與子宮頸鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系 hCTR1蛋白的表達(dá)在不同年齡、臨床分期、腫瘤大小、病理分級及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移子宮頸鱗癌患者間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表2。

2.4 hCTR1原發(fā)子宮頸鱗癌和復(fù)發(fā)子宮頸鱗癌中的表達(dá)情況 hCTR1在子宮頸原位癌的陽性率高于子宮頸早期浸潤癌；hCTR1蛋白在原發(fā)子宮頸鱗癌和復(fù)發(fā)子宮頸鱗癌中表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表3。術(shù)后1年隨訪，原發(fā)組宮頸癌患者共39例，1例轉(zhuǎn)院，其中臨床分期Ⅰb期患者2例，術(shù)后僅進(jìn)行了放療，其余37例患者術(shù)后進(jìn)行放、化療，通過對hCTR1蛋白的檢測，化療采取博來霉素+順鉑方案（PF），患者情況良好，無局部復(fù)發(fā)。另12例復(fù)發(fā)癌患者，通過對hCTR1的檢測，婦科臨床調(diào)整了cDDP使用劑量，情況良好，目前無二次復(fù)發(fā)。

Table 3 The protein expression of hCTR1 in primary cervical squamous carcinoma,recurrent cervical squamous carcinoma and early invasive carcinoma表3 hCTR1蛋白在原發(fā)子宮頸鱗癌、復(fù)發(fā)子宮頸鱗癌和早期浸潤癌中表達(dá) 例（%）

3 討論

3.1 hCTR1負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)抗腫瘤的鉑類化合物 目前比較認(rèn)同子宮頸癌化療最有效的藥物是鉑類藥物，cDDP是比較常用的化療藥物，以cDDP為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療的有效率可達(dá)80%以上[4]。hCTR1蛋白被認(rèn)為是人體內(nèi)具有高親和力的銅攝入蛋白，可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中cDDP的含量。該基因位于染色體9q31/32上，編碼蛋白存在于真核生物細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中高爾基體上[5]。Holzer等[6]研究顯示，細(xì)胞膜上主要負(fù)責(zé)銅進(jìn)入的載體——CTR1，也是負(fù)責(zé)cDDP進(jìn)入酵母體和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的不可缺少的部分。近來研究發(fā)現(xiàn)，很多類型的腫瘤患者血清中含有異常高水平的銅；且銅與化療藥物cDDP關(guān)系密切，并且認(rèn)為銅可能影響化療效果[7-8]。銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族不僅參與銅離子的代謝,也參與鉑類抗腫瘤藥物入胞和出胞的調(diào)節(jié)[5]，銅和cDDP是相反的的兩極，但它們的吸收受相似的細(xì)胞外因子影響，如K+離子的濃度和pH值等。Holzer等[6]將人類卵巢惡性腫瘤細(xì)胞暴露于2μmol/L的 cDDP中15 min，結(jié)果顯示腫瘤細(xì)胞上的hCTR1完全消失，認(rèn)為cDDP引起hCTR1丟失，可能與細(xì)胞膜和細(xì)胞間橋的重新分布有關(guān)，但當(dāng)移去cDDP 30 min后，腫瘤細(xì)胞的hCTR1蛋白水平又恢復(fù)正常，表明hCTR1的合成是快速的。Petris等[9]研究認(rèn)為，利用化學(xué)抑制劑β-甲基環(huán)糊精可阻止cDDP誘導(dǎo)的哺乳動(dòng)物的hCTR1丟失。于海林等[10]通過構(gòu)建重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體pBABEpuro-hCTRI，轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞后感染人卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3，結(jié)果顯示hCTR1參與卵巢癌細(xì)胞對cDDP的轉(zhuǎn)運(yùn)，其高表達(dá)可增強(qiáng)SKOV-3細(xì)胞對cDDP攝入能力和敏感性。

3.2 hCTR1蛋白的表達(dá)與子宮頸鱗癌患者臨床病理關(guān)系 Holzer等[11]報(bào)道hCTR1在多種組織中表達(dá)，尤其在胰腺的α細(xì)胞、胃黏膜及細(xì)支氣管黏膜的內(nèi)分泌細(xì)胞、甲狀腺的C細(xì)胞等。但hCTR1在正常子宮頸組織、CIN及子宮頸鱗癌組織中的表達(dá)情況尚少見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，hCTR1在子宮頸原位癌中的陽性要高于子宮頸早期浸潤癌，提示hCTR1與惡性腫瘤生物學(xué)特征侵襲性可能存在負(fù)相關(guān)性，其確切的生物學(xué)功能尚需要進(jìn)一步研究證實(shí)。研究認(rèn)為，細(xì)胞中hCTR1的合成與谷胱甘肽（L-Glutathione,GSH）和 β-甲基環(huán)糊精含量有關(guān)，增加GSH含量可提高的腫瘤細(xì)胞對cDDP的敏感性[7-8]。因此，腫瘤患者在化療期間可以給予GSH或β-甲基環(huán)糊精進(jìn)行人為干預(yù)，減少腫瘤細(xì)胞中hCTR1蛋白的流失，促進(jìn)其合成，提高腫瘤細(xì)胞對抗腫瘤藥物的敏感性，從而降低腫瘤患者的病死率。本研究術(shù)后一年的隨訪及相應(yīng)治療方案證實(shí)了hCTR1蛋白在放化療中的輔助應(yīng)用。綜上所述，通過檢測hCTR1蛋白表達(dá)，從而對這些轉(zhuǎn)運(yùn)體活性進(jìn)行調(diào)節(jié)，可提高腫瘤細(xì)胞對抗腫瘤藥物的敏感性，輔助建立鉑類抗癌藥物耐藥的警示系統(tǒng)。

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