宋衍秋 趙莉莉 毛用敏 趙鴻銘 崔讓莊

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）的病理機(jī)制為多種原因造成的心室功能減弱，心排出量下降，致心臟前后負(fù)荷增加。病變過程中伴隨著交感神經(jīng)系統(tǒng)、腎素-血管緊張素系統(tǒng)及神經(jīng)內(nèi)分泌-細(xì)胞因子系統(tǒng)的激活，并伴隨著心肌細(xì)胞凋亡及心室重塑。B型利鈉肽 （B-type natriuretic peptide，BNP）為左心室肌細(xì)胞合成并分泌的一種肽類激素，其主要作用是利鈉利尿、擴(kuò)張靜脈、抑制交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮性及拮抗腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)活性，滿足了作為治療心力衰竭藥物的多項(xiàng)要求，對治療CHF具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用基因重組腺病毒Ad-hBNP腹腔注射CHF大鼠，觀察其對CHF大鼠心肌細(xì)胞凋亡因子及Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)的影響。

Table 1 The PCR primers and conditions of different genes表1目的基因PCR反應(yīng)引物序列及實(shí)驗(yàn)條件

1 材料與方法

1.1 建立CHF大鼠模型 健康Wistar雄性大鼠40只，8周齡，體質(zhì)量250～300 g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SCXK-（軍）2007-004。隨機(jī)分為正常對照組（10只），假手術(shù)組（10只）及模型組（20只）。實(shí)驗(yàn)動物適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境1周后。采用腹主動脈縮窄術(shù)法建立CHF大鼠模型。模型組術(shù)前禁食，僅給予5%葡萄糖溶液8 h，自由飲用，0.4%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，腹部正中切口，鈍性分離腹主動脈，于右腎動脈分支處上方0.5 cm將腹主動脈挑起，平行放置6號鈍針頭（直徑0.6 mm），結(jié)扎，抽出針頭，使腹主動脈部分縮窄，狹窄處直徑為0.6 mm，確認(rèn)無出血后，關(guān)閉腹腔。假手術(shù)組于右腎動脈分支上方0.5 cm處挑起腹主動脈后，只穿線不結(jié)扎，余同模型組。術(shù)后禁食并予5%葡萄糖溶液12 h，自由飲用，逐漸恢復(fù)正常飲食。予以青霉素40萬U連續(xù)3 d肌內(nèi)注射以預(yù)防感染。術(shù)后12周通過超聲心動圖測定左室舒張末徑 （left ventrieular end diastolic dimension，LVEDD）、左室收縮末徑（left ventricular end systolic dimension，LVESD）、左室射血分?jǐn)?shù) （left ventrieular ejection fraction，LVEF）、 左室 短軸縮短率 （left ventrieular fractional shortening，LVFS），比較 3組的上述指標(biāo)，若模型組的指標(biāo)與假手術(shù)組和對照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明CHF造模成功，并據(jù)此確定CHF入選標(biāo)準(zhǔn)，獲得CHF成模大鼠，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 慢性心衰大鼠分組及給藥方法 另選取符合CHF入選標(biāo)準(zhǔn)的CHF成模大鼠30只，隨機(jī)分為3組，治療組 （AdhBNP組）14只，空白腺病毒組（Ad-Track組）8只，生理鹽水組 （NS組）8只。Ad-hBNP組予以腹腔注射2.5×1010VP/mL重組腺病毒Ad-hBNP（天津市心血管病研究所）1 mL；Ad-Track組腹腔注射 2.5×1010VP/mL空白腺病毒 Ad-Track 1 mL；NS組腹腔注射生理鹽水 1mL，3組均每周注射1次，共4周。另選取10只腹主動脈縮窄假手術(shù)大鼠不予以任何處理，作為假手術(shù)組。實(shí)驗(yàn)大鼠于溫度18℃～25℃，濕度40%～60%，12 h明暗交替的環(huán)境飼養(yǎng)，予以標(biāo)準(zhǔn)鼠料，自由進(jìn)食、水。各組動物于給藥4周后行RT-PCR檢測心肌組織Bcl-2、Bax、Caspase-3及Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA含量。

1.3 RT-PCR法測定心肌組織 Bcl-2、Bax、Caspase-3及Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA含量 右側(cè)頸動脈插管注射10%KCl 2 mL處死大鼠，使大鼠心臟處于舒張期，迅速剖胸，分離心臟，冰生理鹽水清洗，濾紙吸干，留取部分心肌組織，-80℃保存。RNAiso Plus試劑（大連寶生物工程有限公司）提取心肌組織中總RNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶（Promega）的作用下逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測定相關(guān)因子的mRNA表達(dá)水平。PCR擴(kuò)增目的基因片段的引物購自上海生工生物工程有限公司，以GAPDH為內(nèi)參照，見表1。

PCR在25μL體系中進(jìn)行，內(nèi)含60 mmol/L Tris-HCl 1.0 μL，15 mmol/L （NH4）2SO41.0 μL，200 μmol/L dNTP 0.5 μL，0.4 mmol/L目的基因上下游引物各0.5μL和0.08 mmol/L內(nèi)參基因上下游引物各0.5μL，1 U Taq DNA聚合酶0.25μL，cDNA1.0μL，補(bǔ)水至25μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃ 變性 30 s，62℃/60℃/58℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。PCR結(jié)束后2%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，拍照，凝膠成像分析軟件測定電泳帶的灰度，用目的基因與內(nèi)參基因電泳條帶的灰度比值表示目的基因的相對含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。對計(jì)量資料先行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 建立CHF大鼠模型 CHF模型組大鼠20只，存活14只，與正常對照組及假手術(shù)組比較，模型組大鼠LVEDD及LVESD均增大，LVEF及LVFS均降低（P<0.01），見表2。可見采用腹主動脈縮窄術(shù)法能夠建立CHF大鼠模型。為確保下一步動物實(shí)驗(yàn)研究的可靠性，制定CHF大鼠的入選標(biāo)準(zhǔn)：LVESD>3.2 mm，LVEDD>6.5 mm，LVEF<0.75，LVFS<40%。

Table 2 Results of echocardiographic measurements in three groups表2 各組大鼠超聲心動圖檢測結(jié)果 （±s）

Table 2 Results of echocardiographic measurements in three groups表2 各組大鼠超聲心動圖檢測結(jié)果 （±s）

*P<0.05，**P<0.01

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2.2 心肌組織Bcl-2、Bax、Caspase-3及Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA含量 Ad-hBNP組Bcl-2 mRNA表達(dá)較Ad-Track組及NS組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；AdhBNP組、Ad-Track組及NS組的Bax mRNA表達(dá)較假手術(shù)組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Ad-hBNP組Caspase-3 mRNA表達(dá)均較Ad-Track組、NS組及假手術(shù)組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ad-hBNP組Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)較Ad-Track組及NS組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Ad-hBNP組Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)較Ad-Track組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Ad-Track組與NS組間Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

Table 3 The expression of Bcl-2,Bax,Caspase-3 and collagen type I&III mRNA in cardiac myocytes of different groups of rats表3 各組大鼠心肌Bcl-2、Bax、Caspase-3及Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá) （±s）

*P<0.05，**P<0.01

?

3 討論

既往認(rèn)為心力衰竭致病的分子基礎(chǔ)是心肌細(xì)胞收縮蛋白異常和肌漿網(wǎng)鈣攝取紊亂[1]，然而隨著對心力衰竭研究的不斷深入，諸多研究充分證實(shí)心室重構(gòu)在心力衰竭的發(fā)生發(fā)展中具有十分重要的作用[2]。心肌細(xì)胞凋亡和心肌間質(zhì)Ⅰ、Ⅲ型膠原的沉積在心室重構(gòu)中具有重要的作用。細(xì)胞凋亡與其相關(guān)基因的表達(dá)和調(diào)節(jié)有關(guān)，其中 Bax、Bcl-2及Caspase-3是調(diào)控凋亡信號途徑的重要基因。

本研究發(fā)現(xiàn)連續(xù)4周Ad-hBNP治療后，CHF大鼠心肌細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)較Ad-Track及NS組升高，Bax mRNA表達(dá)較Ad-Track及NS組有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Caspase-3 mRNA表達(dá)較Ad-Track及NS組均升高。提示BNP對心肌細(xì)胞的凋亡具有雙重作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，BNP能通過抑制線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔的開放使心肌細(xì)胞免于凋亡和損傷[3]。一些文獻(xiàn)也報(bào)道不同濃度的BNP對心肌細(xì)胞的凋亡具有雙重作用，低濃度BNP通過環(huán)磷酸鳥苷 （cGMP）途徑促進(jìn)細(xì)胞增殖；高濃度的BNP通過非cGMP途徑抑制細(xì)胞增殖。在急性心肌梗死模型中，短時(shí)間地應(yīng)用低劑量的外源性BNP（0.001～0.01 μg·kg-1·min-1）通過一氧化氮合酶信號通路抑制心肌細(xì)胞凋亡來限制心肌梗死面積[4]。兔缺血再灌注模型中，BNP能通過抑制Caspase-3活化和心肌細(xì)胞凋亡預(yù)防心肌缺血再灌注損傷[5]。然而，D’Souza等[6]證實(shí)BNP可影響心肌的重塑。心肌梗死后心肌BNP表達(dá)持續(xù)增高，持續(xù)增高的BNP可抑制成纖維細(xì)胞活性和促心肌細(xì)胞凋亡，可能是高濃度BNP對細(xì)胞增殖的反向調(diào)節(jié)。BNP具有促凋亡和抑凋亡的雙重特性，可能與其實(shí)驗(yàn)條件、外源性腦鈉素劑量及使用時(shí)間等有關(guān)。另外，機(jī)械牽拉可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，BNP的生理作用能對抗機(jī)械牽拉誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而在體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中這種作用消失，或許可以解釋BNP對體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞具有促凋亡的作用，而對在體研究的心肌細(xì)胞則呈雙向作用這一矛盾現(xiàn)象，其機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

心肌細(xì)胞外基質(zhì)主要由膠原蛋白和纖維連接蛋白等共同形成的一個(gè)相互連接的復(fù)雜三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，其主要成分是Ⅰ、Ⅲ型膠原。近年來研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞外基質(zhì)對于維持心臟正常的結(jié)構(gòu)、心肌間力的正常傳導(dǎo)及心肌舒縮協(xié)調(diào)性等具有重要意義。當(dāng)心肌組織發(fā)生病理性變化而出現(xiàn)凋亡或壞死，由于心肌細(xì)胞屬于終末細(xì)胞，不具有再生能力，病變部位的組織將由細(xì)胞外基質(zhì)充填，此時(shí)膠原蛋白的生成將會增加，改變了心肌組織正常的結(jié)構(gòu)和功能。本研究發(fā)現(xiàn)重組腺病毒Ad-hBNP連續(xù)治療CHF大鼠4周后其Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)均低于Ad-Track組。原因可能是外源性BNP對心肌細(xì)胞凋亡調(diào)控基因的影響，從而使膠原蛋白的生成趨于正常。

綜上所述，外源基因hBNP能影響CHF大鼠心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，減少心肌細(xì)胞間質(zhì)Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)。

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[4]Ren B,Shen Y,Shao H,etal.Brain natriuretic peptide limits myocardial infarct size dependent of nitric oxide synthase in rats[J].Clin Chim Acta,2007,377(1-2):83-87.

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[6]D’Souza SP,Yellon DM,Martin C,etal.B-type natriuretic peptide limits infarct size in rat isolated hearts via KATP channel opening[J].Am JPhysiol Heart Circ Physiol,2003,284(5):H1 592-600.