郭仁德王偉忠 顧建華王 毅 谷 川

胰腺癌發(fā)生胰周神經浸潤的比例高達53.5%～100%[1]，神經浸潤被認為是導致腫瘤局部復發(fā)、轉移和預后不良的極為重要的因素，但其確切分子機制至今尚不明確。近年來的一些研究表明，由胰腺內外的神經組織產生的許多神經營養(yǎng)因子、黏附分子參與了胰腺癌的神經侵襲過程，其中膠質細胞源神經營養(yǎng)因子（GDNF）在此過程中的作用日益受到重視[2]?；|金屬蛋白酶（MMP）是一個蛋白水解酶家族，可促進細胞外基質（ECM）中蛋白成分的降解，在腫瘤細胞侵犯中起非常重要的作用[3]。近年來有研究顯示MMP-9在胰腺癌中過度表達，并且與蛋白水解反應、淋巴侵犯及GDNF的表達相關[4]。本研究采用不同檢測方法，旨在探討胰腺癌細胞中GDNF對MMP-9表達的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 人胰腺癌細胞株MIA PaCa-2（M.D.Andson癌癥中心饋贈），Capan-2（中南醫(yī)學院附屬醫(yī)院饋贈），GDNF蛋白（天津市津脈基因測繪技術有限公司），鼠抗人RET單克隆抗體 （北京中杉生物技術有限公司），MMP-9多克隆抗體、TaqDNA聚合酶（美國Santa Cruz公司），MMP-9 ELISA試劑盒 （北京中杉生物技術有限公司），試劑盒TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0，Bradford蛋白濃度測定試劑盒 （天津灝洋）。普通PCR儀:GeneAmp PCR Systerm 9700， 梯度 PCR 儀：Mastercycler gradient，KODAK 凝膠成像系統(tǒng):Kodak digital science image station 440，酶標儀（TECAN A-5082）。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR檢測胰腺癌細胞中GDNF對MMP-9 mRNA表達的影響 胰腺癌MIA PaCa-2和Capan-2細胞培養(yǎng)，對照組用DMEM培養(yǎng)基，實驗組加入100μg/L GDNF培養(yǎng)24 h。胰腺癌RNA提取，進行濃度測定和質量判定，RT-PCR法檢測胰腺癌細胞中MMP-9的表達。MMP-9引物應用Oligo 6.0軟件自行設計。引物由上海生工生物技術有限公司合成。序列上游：5′-TCTGGAGGTTCGACGTGAAG-3′；下游：5′-GGGCACTGCAGGATGTCATA-3′， 引物長度 220 bp。PCR反應體積為25μL，含 cDNA模板 2μL以及 1.5μmol/L MgCl2、50μmol/L dNTPs、上下游引物各0.1 μmol/L 和TaqDNA聚合酶1 U。反應條件如下：94℃預變性3 min，94℃變性45 s、53℃退火45 s、72℃延伸1 min，共35個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃終止反應。反應完成后，取5μL擴增產物常規(guī)進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增產物。每次擴增均設DMEM陰性對照組，每組5孔，各重復5次。

1.2.2 Western blot法檢測GDNF對MMP-9蛋白表達的影響 胰腺癌細胞培養(yǎng)，對照組用DMEM培養(yǎng)基，實驗組加入100μg/L GDNF培養(yǎng)24 h,每組5孔。消化離心收集細胞后，PBS清洗3遍，將細胞置于1.5 mL EP管中，加入1 mL（含1%PMSF）的RIPA裂解液，搖勻置于冰上裂解30 min，裂解后于4℃下12 000 r/min離心5 min，取上清液并測定蛋白濃度，取40μg蛋白與上樣緩沖液混合，煮沸5 min，置于十二烷基硫酸鈉（SDS）變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、電轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，用 1%牛血清白蛋白（BSA）封閉，用稀釋度1∶1 000的兔抗人MMP-9多克隆抗體4℃過夜，加入相應的二抗室溫下孵育60 min，按試劑盒說明書進行抗體檢測。

1.2.3 ELISA法檢測GDNF對MMP-9蛋白表達的影響 根據標準品光密度（OD）450值畫出標準曲線，MIA PaCa-2和Capan-2胰腺癌細胞培養(yǎng)，待培養(yǎng)液中細胞貼壁生長且基本鋪滿瓶底，細胞狀態(tài)良好時，胰酶消化、細胞計數，將細胞制成2×104/mL懸液。將細胞懸液加入96孔板，每孔加入200 μL培養(yǎng)液。每種細胞分別設置7組：GDNF最終質量濃度分別為0、10、20 、50、80、100 和 120 μg/L，每組 5 孔。37 ℃，5%CO2分別培養(yǎng)24、48和72 h。移液器分別取100μL培養(yǎng)基酶標儀檢測OD450值。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0軟件包，兩均數間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多個均數間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 GDNF對MMP-9 mRNA表達的影響 MIA PaCa-2和Capan-2兩種胰腺癌細胞系中，實驗組MMP-9表達條帶較對照組明顯增粗、變亮，見圖1、2。

2.2 Western blot法檢測GDNF對MMP-9蛋白表達的影響 MIA PaCa-2和Capan-2兩種胰腺癌細胞系中，對照組有很弱的MMP-9蛋白的表達，而實驗組MMP-9蛋白表達明顯增強，見圖3。MIA PaCa-2和Capan-2細胞系中對照組MMP-9蛋白表達分別為1.3±0.2和1.1±0.4，實驗組分別為1.9±0.3和1.8±0.7，2組比較差異有統(tǒng)計學意義 （t分別為3.171 和 3.219，均 P<0.01）。

Figure 1 The influence of GDNF on the expression of MMP-9 mRNA in MIA PaCa-2 human pancreatic carcinoma cell line圖1 MIA PaCa-2胰腺癌細胞系中GDNF對MMP-9 mRNA表達的影響

Figure 2 The influence of GDNF on the expression of MMP-9 mRNA in Capan-2 human pancreatic carcinoma cell line圖2 Capan-2胰腺癌細胞系中，GDNF對MMP-9 mRNA表達的影響

Figure 3 The expression of MMP-9 protein圖3 MMP－9蛋白的表達

2.3 ELISA法檢測GDNF對MMP-9蛋白表達的影響 MIA PaCa-2和Capan-2胰腺癌細胞系中，均可見代表MMP-9蛋白表達水平的OD450值隨加入GDNF值的增高而增高，于GDNF濃度為100μg/L，48 h 時達最大值，見圖4、5，表1、2。

3 討論

胰腺癌在生物學行為上具有高度侵襲性，腫瘤很小時即可有神經、血管或周圍淋巴的侵犯，甚至遠處轉移，已屬于晚期胰腺癌，即使獲得手術切除，術后也很快復發(fā)和轉移，預后仍然很差。近年來，隨著影像醫(yī)學的發(fā)展，一些早期胰腺癌可被發(fā)現，但侵襲與轉移仍是治療失敗和因瘤死亡的主要原因。腫瘤侵襲和轉移的過程主要依賴于侵襲性腫瘤細胞蛋白溶解活性的增強 。MMPs、組織蛋白酶B和D以及纖溶酶原激活物是參與轉移級聯(lián)過程（metastaticcascade）的化學物質[5]。

Figure 4 The influence of GDNF on the expression of MMP-9 protein in MIA PaCa-2 human pancreatic carcinoma cell line圖4 MIA PaCa-2胰腺癌細胞系中GDNF對MMP－9蛋白表達的影響

Figure 5 The influence of GDNF on the expression of MMP-9 protein in Capan-2 human pancreatic carcinoma cell line圖5 Capan－2胰腺癌細胞系中GDNF對MMP－9蛋白表達的影響

Table 1 Statistics of influence of GDNF on the expression of MMP-9 protein in MIA PaCa-2 human pancreatic carcinoma cell line表1 MIA PaCa-2胰腺癌細胞系中GDNF對MMP－9蛋白表達影響的統(tǒng)計量

Table 2 Statistics of influence of GDNF on the expression of MMP-9 protein in Capan-2 human pancreatic carcinoma cell line表2 Capan-2胰腺癌細胞系中GDNF對MMP－9蛋白表達影響的統(tǒng)計量

MMPs是一組鋅離子依賴性的內肽酶，屬于蛋白水解酶的一種，它的作用底物較多，有纖維膠原蛋白、彈性蛋白、層黏連蛋白、明膠及蛋白多糖等，幾乎能降解細胞外基質的所有成分。近年來的實驗研究發(fā)現MMP在惡性腫瘤的侵襲及轉移中發(fā)揮著重要作用。目前，MMPs家族由11個成員組成。根據其結構和底物特異性將其劃分成4組：膠原酶、白明膠酶、基質降解酶及其他。MMP-9又稱為明膠酶B，是MMPs中分子量最大的酶。以酶原形式分泌，被激活后形成Ⅳ型膠原酶，降解、破壞靠近腫瘤表面的Ⅳ型、V型膠原和明膠，然后腫瘤細胞沿著缺失的基底膜向周圍浸潤，最終導致腫瘤的侵襲和轉移。另一方面則通過毛細血管內生、新生血管生成等促進腫瘤浸潤和轉移[6]。因此，MMP-9在癌細胞浸潤、轉移中起重要作用。

Okada等[7-8]對GDNF是否能調節(jié)人胰腺癌細胞MMP-9的表達和活性進行了研究，結果顯示GDNF提高MIA PaCa－2細胞株中MMP-9 mRNA和蛋白質表達是有劑量依賴性的。GDNF增強了前體和活性形式MMP-9溶解明膠的能力。抑制物試驗顯示前體MMP-9的表達和活性能被genistein完全抑制，被Wortmannin部分抑制，而PD98059沒有影響。三者都能抑制MMP-9的活性，說明在MIA PaCa-2中，GDNF通過不同的信號傳導通路上調MMP-9的表達和酶活性，GDNF可能通過調控MMP-9的表達和活性促進了胰腺癌的侵犯。本研究利用RT-PCR法檢測GDNF對MMP-9 mRNA表達的影響，結果顯示加入100μg/L GDNF后，MMP-9 mRNA的表達明顯增強，提示胰腺癌細胞中GDNF能上調MMP-9 mRNA的表達。

本研究應用Western blot法檢測檢測GDNF對MMP-9蛋白表達的影響，對照組有很弱的MMP-9蛋白的表達，而加入100μg/L GDNF組MMP-9蛋白表達明顯增強，采用雙夾心ELISA法檢測GDNF對MMP-9蛋白表達的影響，顯示代表MMP-9蛋白表達水平的OD450值隨加入GDNF值的增高而增高，于GDNF濃度為100μg/L，作用48 h達最大值，提示GDNF可上調MMP-9蛋白的表達。但是由于MMP-9蛋白表達量較低，未能從標準曲線中讀取具體數值，還需一種更為精細的方法來測量。

綜上所述，GDNF具有上調胰腺癌細胞MMP-9表達的作用,可促進MMP-9 mRNA及蛋白的表達，從而增強胰腺癌細胞的侵襲能力。

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