劉麗均，郁麗麗，王俊鳳，張藝寶，李 淼，施美蓮，廖 侃，徐 平

(1.上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，上海 201615;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，南京 210006;3.中科院上海實驗動物中心，上海 201615)

配子和胚胎的冷凍保存技術(shù)可以使胚胎生物技術(shù)的運用不受時間和空間的限制，對基礎(chǔ)研究、商業(yè)運用以及建立大型的胚胎庫有著重要的意義。在各種冷凍保存技術(shù)中，卵子的冷凍保存有著自己的特色和難點，雖然卵子冷凍保存可以充分利用卵巢中的卵子，為各項生物技術(shù)的開展隨時提供材料;為高齡、卵巢早衰或有惡性腫瘤的患者提供生育機會;保存優(yōu)良品種和瀕危動物資源，但是卵細胞體積巨大，細胞質(zhì)豐富，細胞器多而復(fù)雜，對于溫度、滲透壓和離子濃度非常敏感［1］，雖然前人做了一些冷凍保存的研究，但是復(fù)蘇后有細胞存活率、受精率均較低，發(fā)育效果不佳［2］等問題。有研究表明卵細胞冷凍復(fù)蘇后透明帶變硬［3］、質(zhì)膜變脆［4］，導(dǎo)致了受精率的低下。本研究從透明帶糖蛋白的角度，來研究冷凍對透明帶糖蛋白的影響，并運用激光打孔技術(shù)來解決因為冷凍而照成的受精率下降的問題，為胚胎生物技術(shù)和輔助生殖技術(shù)提供解決的新方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

C57BL/6J，雌鼠，4周，SPF級，來源于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司(生產(chǎn)許可證:SCXK(滬)2007-0005;使用許可證:SYXK(滬)2007-0005);

C57BL/6J，BKS．Cg － Leprdb/+Leprdb/Jc(以下簡 稱 Db+/－ )，C57BL/6 BKS，MXβ-Catenin，MKP-5，Sir-168，C57BL/6-Tg(hislit2)(以下簡稱Hislit-2)，B6.129S7-Ifngtm1TS(以 下 簡 稱 Ifng)，C57BL/6 TRL 4KO(以下簡稱4KO)雄鼠，10周，均來源于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司(生產(chǎn)許可證:SCXK(滬)2007-0005;使用許可證:SYXK(滬)2007-0005)。

所有動物都在SPF的環(huán)境中，自由采食，自由飲水，光照控制為 10 h∶14 h(AM．8:00－PM．6:00光周期)。

1.2 實驗方法

1.2.1 試劑:HTF(human tube fluid)，精子獲能液及受精液，自己配置，配置方法參考 Quinn．P(1985)［5］;所用試劑均為 SIGMA 公司;

R18S3，精子冷凍保護劑，配置方法參考Nakagata(1992)［6］，所用試劑均為 SIGMA 公司;

EFS20，卵子冷凍保護劑，含20%乙二醇的 FS(Ficoll PM-Sucrose，簡稱 FS液)液;EFS40:含 40%乙二醇的 FS液;FS:含30%Ficoll PM 70的 PB1溶液。

兔抗人透明帶糖蛋白-2抗體(一抗):SIGMA，貨號HPA01126;

羊抗鼠抗體(二抗):Alexa FluarR488 Donkey Anti-Mouse TgG，molecular probes A21202;

鬼筆環(huán)肽phalloidin:SIGMA，貨號P1951;Hoechst:SIGMA，貨號 B1155。

激光打孔儀器由美國HAMILTON THORNE公司出品，型號為 XYClone Class I Laser Product，參數(shù)為 pulse=260，power=100%;

1.2.2 方法:

1.2.2.1 精子處理過程:①精子獲能:各個品系的成年雄鼠，頸椎脫臼處死，剝離附睪尾部，擦拭血液和組織液，在尾部剪口，挑出精子團，放入預(yù)先平衡的HTF溶液中，37℃獲能1.5 h;

②精子冷凍:成年雄鼠，頸椎脫臼處死，剝離附睪尾部，擦拭血液和組織液，在尾部剪口，挑出精子團，放在R18S3中，待精子散開后，10 μL每管轉(zhuǎn)入麥管中，液氮上面預(yù)冷10 min后，投入液氮;

③精子復(fù)蘇:麥管從液氮中取出，37℃水浴鍋中10 min后，將精子懸浮液轉(zhuǎn)入 HTF溶液中，37℃獲能1.5 h;

1.2.2.2 卵子處理過程 ①卵子獲得:C57BL/6J，雌鼠，腹腔注射孕馬血清(pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)48 h后，腹腔注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)，在hCG處理14～16 h后，頸椎脫臼處死雌鼠，分離膨大部，挑出卵子-卵丘細胞復(fù)合物(cumulus-oocyte complex，COC)，用透明質(zhì)酸酶消化成裸卵，反復(fù)清洗，去除透明質(zhì)酸酶的影響，放入預(yù)先平衡的 HTF溶液中;

②卵子冷凍及復(fù)蘇:(1)冷凍:上述裸卵，EFS20 0℃預(yù)冷2 min后，放入0℃的EFS40中，1 min后，立即投入液氮。(2)復(fù)蘇:卵子冷凍一周后，從液氮中取出，加入0.75 mol/L的蔗糖溶液，靜止片刻轉(zhuǎn)入0.25 mol/L的蔗糖溶液中，清洗3次后，HTF培養(yǎng)待用;

③卵子打孔:選擇形態(tài)正常的新鮮裸卵，或者復(fù)蘇后形態(tài)正常的裸卵，在 power=260，power=100%條件下打孔，打孔后的卵子于HTF溶液中培養(yǎng)待用。

1.2.2.3 體外受精 上述復(fù)蘇裸卵，以及復(fù)蘇后打孔的卵子，加入新鮮獲能精子或復(fù)蘇后獲能精子懸浮液，培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。第2天計數(shù)二細胞胚胎的數(shù)量。

1.2.2.4 免疫熒光染色:①卵子分組:a)新鮮卵子，透明質(zhì)酸酶消化后，HTF培養(yǎng)待用;2)經(jīng)過酶消化的卵子，冷凍30 min后復(fù)蘇，HTF培養(yǎng)待用;3)經(jīng)過酶消化的卵子，冷凍1周后復(fù)蘇，HTF培養(yǎng)待用;4)經(jīng)過酶消化的卵子，進行正常的冷凍，但是不投入液氮，然后正常復(fù)蘇，HTF培養(yǎng)待用;

②上述各組裸卵，PBS清洗3次;4%PFA-PBS常溫固定;

③TTBS-1%BSA封閉過夜;

④加入兔抗人透明帶糖蛋白一抗(HPA01126，SIGMA)，常溫 1 h;

⑤TTBS清洗數(shù)次后，加入羊抗鼠的二抗、phalloidin、Hoechst，避光染色 1 h;

⑥封片過夜后，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.3 結(jié)果統(tǒng)計

1.3.1 受精率的計算:受精率=二細胞的數(shù)量/液滴中總的細胞數(shù)量(二細胞+未受精的單細胞+異常的細胞);

1.3.2 將受精率采用arc-sin對數(shù)轉(zhuǎn)換后，做統(tǒng)計分析，采用 SPSS分析軟件，單因素方差分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 C57BL/6J小鼠卵子冷凍前后細胞核、微絲及透明帶糖蛋白-2的變化研究

C57BL/6J小鼠卵子，用兔抗人透明帶糖蛋白2抗體標(biāo)記透明帶糖蛋白，然后用羊抗兔的二抗顯示，結(jié)果如彩插4圖1圖所示;所有卵子的微絲，用鬼筆環(huán)肽標(biāo)記，結(jié)果如彩插4圖2所示;細胞核用Hochest標(biāo)記，結(jié)果如彩插4圖3所示。從4組圖中可以看出，新鮮卵子的透明帶糖蛋白-2完好無損，微絲結(jié)構(gòu)完整，細胞核明亮。冷凍一周后復(fù)蘇的卵子，以及冷凍30 min后復(fù)蘇的卵子，透明帶熒光變暗淡，外圍出現(xiàn)斷裂不完整處，微絲顏色略變暗，邊緣有不完整，細胞核一切正常，沒有明顯變化。經(jīng)過冷凍保護劑處理而沒有冷凍的卵子，除了細胞核正常外，透明帶熒光變得暗淡，結(jié)構(gòu)明顯不完整，多處出現(xiàn)斷裂，微絲結(jié)構(gòu)斷裂，不完整，呈現(xiàn)出細胞皺縮狀態(tài)。

2.2 C57BL/6J小鼠復(fù)蘇卵子和復(fù)蘇后打孔卵子體外受精的研究

C57BL/6J小鼠雌鼠，4周，超排后取卵，如上述處理后與9個品系的雄鼠進行了體外受精實驗，從下表中可以看出，C57BL/6J小鼠的卵子，冷凍后，受精能力下降，與新鮮精子受精，受精率平均在15～30%之間，經(jīng)過打孔后，平均受精率在40% ～70%之間。復(fù)蘇后的卵子與復(fù)蘇后的精子受精，受精率變化較大，從5～25%都有，與不同的雄鼠品系有關(guān)，復(fù)蘇卵子打孔后，與復(fù)蘇精子受精，可以使受精率提高至20% ～40%，同品系不同組之間比較，差異顯著(P＜0.05)。

3 討論

Hochest是一種小分子熒光染料，可以特異性的和DNA結(jié)合，四種分組中，均可以看出細胞核的明顯的位置，熒光強弱無明顯差異，說明冷凍與否并不會損傷卵子的DNA，這也是為什么可以通過冷凍保存配子、胚胎來保存動物資源的理論依據(jù)。細胞骨架是指真核細胞中的蛋白纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，由微絲、微管和中間纖維構(gòu)成。其中微絲確定細胞表面特征，使細胞能夠運動和收縮。鬼筆環(huán)肽(phalloidin)與微絲能夠特異性的結(jié)合，熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽可特異性的顯示微絲結(jié)構(gòu)在細胞中的分布［7］。4種分組的圖片顯示，被鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的微絲結(jié)構(gòu)，無論在新鮮卵子，還是冷凍復(fù)蘇的卵子，抑或EFS處理的卵子，微絲有變化但是差異不大，在卵子細胞膜下表現(xiàn)出完整的結(jié)構(gòu)，這說明冷凍復(fù)蘇過程并沒有嚴重損傷微絲的結(jié)構(gòu)。也可能是因為微絲雖然在低溫下易解聚，但是復(fù)蘇的卵子經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，解聚的微絲可以重新組裝起來，維持卵子正常的形態(tài)［8］。經(jīng)過 EFS處理組的微絲，可以看出細胞明顯皺縮，可能是高濃度的冷凍保護劑照成細胞內(nèi)外滲透壓的改變，使得微絲也發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，卵子呈現(xiàn)皺縮。

表1 C57BL/6J小鼠復(fù)蘇卵子和打孔卵子體外受精率的比較Tab.1 Comparing the IVF rate of C57BL/6J post-thawed oocytes and laser-punched oocytes

冷凍對細胞照成的傷害，主要在于以下幾個方面，一是高濃度的冷凍保護劑對細胞的毒害;二是冷凍過程對細胞的過度刺激，三是在冷凍過程中可能形成的細胞內(nèi)致死性冰晶，四是復(fù)蘇時由于細胞膜內(nèi)外滲透壓的改變可能照成的細胞膜破裂［9，10］。本實驗表明，對于卵子來說，冷凍造成的受精率的低下還有一個重要的原因是卵子透明帶變化。小鼠的透明帶主要有3個糖蛋白構(gòu)成，ZP1、ZP2、ZP3，其中ZP3是精子結(jié)合透明帶的第一個結(jié)合部位，精子結(jié)合ZP3后，發(fā)生頂體反應(yīng)，暴露頂體內(nèi)膜，然后與ZP2繼續(xù)結(jié)合，發(fā)生一系列復(fù)雜反應(yīng)后，穿過透明帶，與細胞膜結(jié)合，再穿過細胞膜發(fā)生受精。有前人報導(dǎo)經(jīng)過冷凍的卵子，細胞內(nèi)皮質(zhì)顆粒的提前釋放，照成透明帶的硬化，影響了透明帶與精子的結(jié)合，照成受精率下降［11－13］。我們運用兔抗人 ZP2抗體，來標(biāo)記小鼠ZP2，研究是否冷凍會對透明帶造成了一定的破損［14－16］。從結(jié)果可以看出，新鮮卵子組綠色熒光亮而且完整，顯示透明帶結(jié)構(gòu)完整，而冷凍一周或冷凍30 min組的卵子，透明帶熒光變?nèi)酰吘売袛嗬m(xù)，說明冷凍后透明帶受到一定程度的破壞，可能是透明帶糖蛋白分子嚴重變形，扭曲，或者發(fā)生了糖鍵的斷裂，從而使得糖蛋白上與精子結(jié)合的位點被破壞，影響了精子與卵子的結(jié)合，卵子冷凍后受精率低下，甚至有些幾乎不能受精。

2004年，HAMILTON公司設(shè)計開發(fā)了激光打孔系統(tǒng)，這套系統(tǒng)應(yīng)用簡單的激光發(fā)生設(shè)備，對哺乳動物的卵子的透明帶進行簡單的打孔，在人類體細胞的核移植研究［17］，疾病模型小鼠的制備［18，19］，以及小鼠ES細胞注射以進行小鼠的遺傳學(xué)研究［20］中得到了充分的運用。本實驗室借鑒這些文章，對于冷凍后因透明帶糖蛋白受損而不能受精的卵子，運用激光打孔技術(shù)，在透明帶上打孔后，使得精子可以直接通過微孔與卵子結(jié)合，受精，從而提高冷凍復(fù)蘇卵子的受精率。從文章的結(jié)果可以看出，9個品系的新鮮精子與C57BL/6J復(fù)蘇卵子受精率為17.6%～42.9%;新鮮精子與復(fù)蘇打孔卵子受精率為29.1% ～72.3%，差異顯著(P＜0.05);9個品系復(fù)蘇精子與復(fù)蘇卵子體外受精率為5.4%～23%;復(fù)蘇精子與復(fù)蘇打孔卵子受精率為16.7% ～48.6%，差異顯著(P ＜0.05)，與Anzai M的結(jié)果類似［21］。說明利用激光打孔技術(shù)可以較好的提高冷凍復(fù)蘇卵子的受精率，提高了卵子的利用效率，也提高了冷凍技術(shù)在生殖工程中的運用。

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