王貴利，白 琳，陳 煒，關(guān)霏霏，高 珊，馬元武，張連峰

(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，北京 100021)

由于大鼠在生理、行為、代謝等方面具有比小鼠更優(yōu)良的特點和最近基因工程大鼠研制技術(shù)的興起，大鼠已成為生命科學和醫(yī)藥研究期待的動物模型。大鼠活體影像分析、組織細胞示蹤、干細胞示蹤等，都需要一個標記蛋白高表達和各種細胞標記率高的大鼠模型。常用的干細胞標記方法有LacZ基因、熒光染料 Hochest和5－溴－2脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)等，這些免疫組化染色的缺陷是只能在組織切片上觀察干細胞的存活、遷移和分化情況，需要犧牲大量的實驗動物來觀察不同時間點干細胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸，無法實時、縱向監(jiān)測干細胞在體內(nèi)的動態(tài)遷移過程［1］。熒光發(fā)光是通過激發(fā)光激發(fā)熒光基團達到高能量狀態(tài)，而后產(chǎn)生發(fā)射光。常用的有紅色熒光蛋白(RFP)和綠色熒光蛋白(GFP)［2］。熒光成像被廣泛用于細胞凋亡、蛋白質(zhì)相互作用、免疫細胞遷移、癌癥及藥物研究等多個領(lǐng)域［3－6］。最近幾年，這項技術(shù)開始被用于干細胞研究，可在活體內(nèi)觀察干細胞的行為和生物學特性及其轉(zhuǎn)歸，準確獲得活體動物體內(nèi)靶位置的干細胞，在各時間點的生長和分化情況，加速了干細胞在腫瘤、組織工程等領(lǐng)域的研究進展［7］。

為滿足科學研究的需要，國內(nèi)外研究者建立了多種熒光轉(zhuǎn)基因大鼠［8］。但由于轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建所采用的啟動子不同、靶基因染色體插入的位置效應(yīng)以及轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的差異，不同熒光轉(zhuǎn)基因大鼠的細胞標記率和標記細胞亞群不同，尤其是骨髓干細胞標記率低，從而影響了大鼠熒光標記干細胞在干細胞研究中的進一步應(yīng)用。本文從建立的16個EGFP轉(zhuǎn)基因大鼠品系中，篩選出一個血液細胞和骨髓干細胞高效標記綠色熒光的轉(zhuǎn)基因大鼠。

1 材料和方法

1.1 EGFP表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因

用PCR法從 pEGFP－N1質(zhì)粒中擴增 EGFP基因，DNA序列分析證實沒有突變(北京三博遠志生物技術(shù)有限公司，中國)。把EGFP基因克隆入系統(tǒng)性表 達 的 chicken β－actin 強 啟 動 子 (Dr．Jun－ichi Miyazaki惠 贈，Institute for Medical Genetics，Kumamoto University Medical Schoo1)下游構(gòu)建EGFP轉(zhuǎn)基因載體［9］。轉(zhuǎn)基因載體用 Sal I線性化(寶生物工程有限公司，中國)，調(diào)整濃度至5 ng/μL，用顯微注射法將線性化的轉(zhuǎn)基因載體注射到SD大鼠的受精卵中(大鼠購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，SCXK(軍)2007－004;SYXK(軍)2009－0003)，用Wistar大鼠作假孕受體(大鼠購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，SCXK(軍)2007－004;SYXK(軍)2009－0003)，制備轉(zhuǎn)基因大鼠(TE2000．U 顯微注射儀)［10］。本實驗方案已經(jīng)得到中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準，批準號為 ILAS－GC－2012－001。

1.2 PCR鑒定EGFP轉(zhuǎn)基因大鼠

轉(zhuǎn)基因大鼠在出生7～9 d用剪趾法標記，收集剪下的組織，用堿裂解法提取基因組 DNA［11］，用PCR對轉(zhuǎn)基因大鼠進行基因表型檢測。EGFP轉(zhuǎn)基因大鼠 PCR引物為 5＇－CGCCACCATGGTGAGCAAG－3＇，5＇－ATGCCGTTCTTCTGCTIC－3＇(Invitrogen 公司，中國)。PCR試劑購自寶生物工程有限公司。

1.3 活體熒光影像系統(tǒng)分析EGFP轉(zhuǎn)基因大鼠

10日齡 F1代 EGFP轉(zhuǎn)基因大鼠，0．1 mL戊巴比妥鈉(2%)麻醉后，放入活體熒光影像系統(tǒng)的暗箱中拍照，SlideBook 4．0軟件進行分析(日本 Roger公司)。

1.4 EGFP轉(zhuǎn)基因大鼠組織表達分析

按正常病理程序犧牲1月齡F1代EGFP轉(zhuǎn)基因大鼠，將全身重要組織器官進行冰凍切片(kica冰凍切片機)。立即在激光共聚焦顯微鏡下觀察和分析。

1.5 大鼠血液細胞和骨髓細胞的熒光分析

1．5．1 大鼠血液和骨髓細胞的獲取

麻醉F1代大鼠后剪尾1 cm，取血液100 μL;用剪刀環(huán)形剪開大鼠踝關(guān)節(jié)處的皮膚，然后沿大鼠小腿的縱軸內(nèi)側(cè)和外側(cè)的中線分別剪開皮膚。分離脛骨的肌肉組織，盡量取凈。在脛骨的兩端骨骺處切開，使用5 mL注射器以PBS緩沖液反復沖洗骨髓腔，收集細胞。吹打細胞成單細胞懸液，50 μm的尼龍濾膜過濾細胞懸液至15 mL離心管中，400 g離心5 min，去上清。

1．5．2 血液和骨髓中紅細胞的去除及熒光分析

用無菌水將紅細胞裂解液(BD Pharm LyseTM Lysing buffer)稀釋10倍，向上述血液和骨髓細胞中加1 mL稀釋后的紅細胞裂解液，靜置5 min后2400 r/min離心5 min。PBS洗一次。吹散過濾，用流式細胞儀(美國BD公司FACSAria)檢測。

1.6 骨髓干細胞的熒光分析

取1×106個大鼠骨髓細胞，分別加入 0．5 μL APC標記的 CD45RA抗體，1 μL PE標記的 CD3抗體，0．3 μL PerCP－Cy5．5 標記的 Thy－1．1 抗體作為單陽管對照，3種抗體同時加入作為實驗管?？贵w4℃孵育1 h后，用 PBS清洗，過濾后用流式細胞儀檢測。

2 結(jié)果

2.1 EGFP表達載體的構(gòu)建和基因表型的鑒定

用PCR克隆EGFP基因，測序結(jié)果表明克隆的cDNA同已報道的序列完全一致。將EGFP基因插入系統(tǒng)性表達的chicken β－actin強啟動子下游構(gòu)建EGFP轉(zhuǎn)基因載體(圖1A)。

用顯微注射法將線性化的轉(zhuǎn)基因載體注射到SD大鼠的受精卵中，轉(zhuǎn)入到假孕受體 Wistar大鼠中，大鼠出生后7～9 d提取基因組DNA，用PCR檢測EGFP轉(zhuǎn)基因首建鼠(圖1B)，得到16只首建鼠。

圖1 EGFP轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建和基因表型的鑒定。Fig．1 Construction of EGFP transgenic vector and genotyping of EGFP transgenic rats with PCR．

2.2 活體熒光影像系統(tǒng)分析綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因大鼠

用戊巴比妥鈉麻醉10日齡F1代EGFP轉(zhuǎn)基因大鼠后，放入活體熒光影像系統(tǒng)的暗箱中拍照，SlideBook 4．0軟件進行分析。由封2圖2可知，SDTgN(ACT－EGFP－1)ZLFILAS 轉(zhuǎn)基因大鼠(Ⅱ)相對于野生型大鼠(Ⅰ)，呈現(xiàn)較強綠色熒光，熒光蛋白在全身多個組織器官中表達，且強于其他轉(zhuǎn)基因大鼠首建鼠(圖略)。

2.3 EGFP轉(zhuǎn)基因大鼠組織表達分析

將1月齡F1代EGFP轉(zhuǎn)基因大鼠全身重要組織器官進行冰凍切片，立即在激光共聚焦顯微鏡下觀察和分析。結(jié)果顯示，對照野生型大鼠各組織器官均無熒光標記，EGFP綠色熒光蛋白在 SD－TgN(ACT－EGFP－1)ZLFILAS 轉(zhuǎn)基因大鼠的心臟、肝臟、肌肉、肺、胰腺、腦、膀胱、胃、腎臟、腸和脾臟中表達，尤其在心臟、肝臟、肌肉、肺、胰腺中表達量較高，在脾臟中表達量較低(彩插1圖3)。

2.4 血液細胞和骨髓細胞中的熒光標記細胞分析

從大鼠脛骨中分離骨髓細胞，從血液中獲得血液細胞，除去紅細胞后，以流式細胞儀分析血液細胞和骨髓細胞中熒光標記細胞的比率，從而篩選獲得高效熒光標記的轉(zhuǎn)基因大鼠。SD－TgN(ACTEGFP－1)ZLFILAS轉(zhuǎn)基因品系的熒光標記細胞比率最高。如圖4所示，血液細胞中熒光標記德細胞占94．4%，骨髓細胞中有90．7%的細胞為熒光標記。

2.5 骨髓干細胞的熒光分析

骨髓細胞通過 CD45RA、CD3、Thy－1．1 抗體染色后，根據(jù)其陽性和陰性可以初步分析出干細胞。單陽的對照管確定了不同抗體染色后的合適電壓，實驗管用 Thy－1．1+CD3－CD45RA－除去紅細胞、淋巴細胞、骨髓中成熟的細胞，檢測大鼠的骨髓干細胞，發(fā)現(xiàn)其中 GFP陽性細胞占了 97．8%(封 2圖5)。

3 討論

圖4 SD－TgN(ACT－EGFP－1)ZLFILAS轉(zhuǎn)基因大鼠血液和骨髓細胞中的熒光標記細胞分析。Fig．4 The ratios of fluorescent labeling cells in blood cells and bone marrow cells in SD－TgN(ACT－EGFP－1)．ZLFILAS

傳統(tǒng)的動物實驗方法需要在不同的時間點犧牲實驗動物以獲得數(shù)據(jù)，得到多個時間點的實驗結(jié)果。利用光學標記的轉(zhuǎn)基因動物模型進行活體熒光成像，直接、實時追蹤并檢測標記細胞在體內(nèi)的活動，標記基因在體內(nèi)的表達;對同一組實驗對象在不同時間點進行記錄，跟蹤同一觀察目標的遷移及變化，可以研究疾病的發(fā)生發(fā)展過程，進行藥物研究及篩選;操作簡便、結(jié)果直觀、測量快速、靈敏度高、費用低廉、所得的數(shù)據(jù)更加真實可信，已廣泛應(yīng)用于生命科學、醫(yī)學研究及藥物開發(fā)等方面［12］。此外，現(xiàn)行的骨髓移植技術(shù)通常檢測供體造血干細胞在受體骨髓中的數(shù)目，是一種終點檢測方法。應(yīng)用轉(zhuǎn)基因大鼠，將熒光標記的造血干細胞移植入脾及骨髓，可以通過熒光發(fā)光實時檢測這些干細胞的后代在動物體內(nèi)的生長和活動。

熒光蛋白在體內(nèi)，尤其是干細胞中的表達必須在強啟動子，如雞 β肌動蛋白 chicken β－actin啟動子或CAG啟動子的驅(qū)動下才能高效進行，在某些啟動子驅(qū)動下表達效果較差，且轉(zhuǎn)基因載體插入位點和拷貝數(shù)對基因表達效率也具有顯著影響［2］。大鼠的骨髓干細胞標記研究較少，我們利用紅細胞裂解液除去紅細胞、利用B淋巴細胞的標記CD45RA，T淋巴細胞的標記CD3除去淋巴細胞，初步去除了骨髓中成熟的細胞［13］。Goldschneider利用體內(nèi)脾克隆形成的方法，發(fā)現(xiàn) Thy－1．1陽性細胞能形成克隆，而陰性細胞不能形成克隆，可以利用 Thy－1．1陽性細胞標記大鼠的骨髓干細胞［14］。因此，我們利用流式分析骨髓中 Thy－1．1+CD3－CD45RA－細胞作為大鼠的骨髓干細胞。

本研究將 EGFP插入 chicken β－actin強啟動子下游，構(gòu)建了系統(tǒng)性表達綠色熒光的轉(zhuǎn)基因大鼠，綠色熒光蛋白在全身多個組織器官和骨髓細胞中表達。其中，SD－TgN(ACT－EGFP－1)ZLFILAS 轉(zhuǎn)基因大鼠94．4%的血液細胞為熒光標記，97．8%的骨髓干細胞標記綠色熒光。該品系綠色熒光轉(zhuǎn)基因大鼠模型將為示蹤基因表達、標記轉(zhuǎn)基因動物、干細胞的分化與定位、研究腫瘤的生物學行為研究，提供有力的工具動物和分子影像學技術(shù)手段。

［1］ Cao YA， WagersAJ． Beilhack A etal． Shiftingfociof hematopoiesis during reconstitution from single stem cells．Proc Natl Acad Sci U S A．2004;101(1):221－226．

［2］ 馮娟，高苒，全雄志等．紅色熒光和綠色熒光轉(zhuǎn)基因大鼠模型的建立［J］．中國實驗動物學報，2007，15(4):267－270．

［3］ Yang M，Baranov E，Moossa AR，et al．Visualizing gene expression by whole—body fluorescence imaging［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2000，97:12278－12282．

［4］ Takada T，Iida K，Awaji T，et al．Selective production of transgenic mice using green fluorescent protein as a marker［J］．Nat Biotechnol，1997，15:458 －461．

［5］ Yang M，Reynoso J，Jiang P，et al．Transgenie nude mouse with ubiquitous green fluorescent protein expresion as a host for human tumors［J］．Cancer Res，2004，64:8651 －8656．

［6］ Sangmi C，Therese A，Kai—C S，et al．Analysis of different promoter systems for efficient transgene expression in mouse embryonic stem cell lines［J］．Stem Cell，2002，20:139 － 145．

［7］ 張曉娟，李小穎，施海霞等．造血干細胞全標記紅色和綠色熒光轉(zhuǎn)基因小鼠的篩選．中國比較醫(yī)學雜志，2011，Vol．21，No．5，14 －17

［8］ Moore AM，Borschel GH，Santosa KA，et al．A transgenic rat expressing green fluorescent protein(GFP)in peripheral nerves provides a new hindlimb model for the study of nerve injury and regeneration．J Neurosci Methods．2012 Feb 15;204(1):19－27．

［9］ Niwa H．Yamamura K，Miyazaki J．Efficient selection for high—expression transfectants with a novel eukaryotie vector［J］．Crene，1991．108:193－200．

［10］ Gordan JW， RuddleFH． Integration and stablegerm line transmission of genes injected into mouse pronuelei［J］．Science，1981．214(4526):1244－1246．

［11］ Truett GE，Heeger P，Mynatt RL，et al．Preparation of PCR－quality mouse genomie DNA with hot sodium hydroxide and tris(Hot SHOT)［J］．Biotechniques，2000，29(1):52 －54．

［12］ Robert M．Advantages of multi－color fluorescent proteins for whole－body and in vivo cellular imaging［J］． J Biomedical Optics，2005，10:041021－0410210

［13］ Marc H．Dahlke，Oliver S．Lauth，Mark D．J?ger，et al．In vivo depletion of hematopoietic stem cells in the rat by an anti－CD45(RT7)antibody．Blood，2002，99:3566－3572

［14］ Golschneider I，Gordon LK，Morris RJ．Demonstration of Thy－1 antigen on pluripotent hematopoietic stem cells in rats．J Exp Med 1978;148:1351－1366．