歐 松，孫克偉，彭建平，祁雙林，聞 杰，胡 莉

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙410007）

乙型肝炎病毒（HBV）感染后慢性乙型肝炎患者外周血免疫細(xì)胞均存在著免疫功能缺陷或低下，其中，以T 淋巴細(xì)胞功能低下為中心的細(xì)胞免疫功能障礙導(dǎo)致的免疫耐受是HBV 持續(xù)感染、慢性乙型肝炎難以治愈的主要原因[1]。既往研究表明中醫(yī)藥在改善機(jī)體免疫狀態(tài)，恢復(fù)和提高免疫細(xì)胞功能，重建免疫應(yīng)答具有較好的作用[2-4]。針對HBV 慢性感染其外因是濕熱疫毒內(nèi)侵，內(nèi)因歸屬脾、腎二臟虧虛[5]，本研究擬運(yùn)用HBV 感染免疫耐受期與免疫清除期患者外周血T 細(xì)胞體外培養(yǎng)的細(xì)胞模型和中藥血漿藥理實(shí)驗(yàn)方法，比較補(bǔ)腎解毒方和健脾解毒方對HBV感染不同免疫狀態(tài)患者的外周血T 細(xì)胞功能的影響，為臨床提高中醫(yī)藥治療慢性乙型肝炎的療效提供指導(dǎo)思路和研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF 級SD大鼠30只，雌雄各半，41 d 齡，（164.2±10.6）g，湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物學(xué)部提供，使用許可證號：SCXK (湘)2009-0004。實(shí)驗(yàn)大鼠于2010年9月24日至2010年10月6日在湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物學(xué)部SPF 級飼養(yǎng)房喂養(yǎng)。

1.2 藥物

補(bǔ)腎解毒方：六味地黃丸（《小兒藥證直訣·卷下》[6]）加甘露消毒丹（《溫?zé)峤?jīng)緯》[7]）化裁：熟地黃24 g，山藥12 g，山茱萸12 g，澤瀉9 g，茯苓9 g，牡丹皮9 g，白蔻仁10 g，藿香10 g，茵陳15 g，滑石30 g，石菖蒲10 g，黃芩10 g，連翹10 g，川貝母10 g，射干10 g，薄荷6 g；健脾解毒方：四君子湯（《太平惠民和劑局方》[8]）加甘露消毒丹化裁：人參、白術(shù)、茯苓、炙甘草各9 g，白蔻仁10 g，藿香10 g，茵陳15 g，滑石30 g，石菖蒲10 g，黃芩10 g，連翹10 g，川貝母10 g，射干10 g，薄荷6 g。飲片均采用道地藥材，由長沙九芝堂股份有限公司提供，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制備，補(bǔ)腎解毒小、中劑量組分別含生藥1.94、9.71 g/mL；健脾解毒小、中劑量組分別含生藥1.58、7.92 g/mL。

1.3 試劑與儀器

BS 緩沖液：天津津脈；淋巴細(xì)胞分離液：天津?yàn)蠊?；RPMI1640：吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；10%胎牛血清(FCS)：美國Hyclone 公司；1%多聚甲醛:天津市化學(xué)試劑研究所；熒光抗體CD3-Percp(多甲藻葉綠素蛋白)，CD4-FITC （異硫氰酸熒光素)，CD8-PE（藻紅蛋白熒光素），CD28-FITC，同型對照IgG2a-Percp，IgG1-FITC，IgG2a-PE，均購自美國ebioscience 公司；水套式CO2培養(yǎng)箱（中國力康發(fā)展有限公司）、倒置生物顯微鏡XD-202 型(南京江南永新光學(xué)有限公司)、FACS Calibur 流式細(xì)胞儀(BD亞洲有限公司)。

1.4 T 細(xì)胞分離與培養(yǎng)

選擇36 例湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科2010年6月至2011年5月門診HBV 慢性感染患者，均符合《慢性乙型肝炎防治指南》[9]診斷標(biāo)準(zhǔn)，均簽署知情同意書。根據(jù)免疫狀態(tài)分為免疫耐受組和免疫清除組，其中免疫耐受組18 例，男12 例，女6 例，平均年齡（28.5±4.56）歲，病程7～22年，平均病程（11.6±4.6）年；免疫清除組18 例，男11 例，女7例，平均年齡（30.2±2.65）歲，病程8～20年，平均病程（12.8±3.4）年。另選擇10 名湖南中醫(yī)藥大學(xué)健康學(xué)生及湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院健康職工作為健康組，其中男6 例，女4 例，平均年齡（25.7±3.5）歲。各組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。運(yùn)用密度梯度離心法，無菌條件下抽取人外周血20 mL，肝素抗凝（50 u/mL），PBS 對倍(1∶1)稀釋，用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral bloodmononuclear cells，PBMCs)，PBS 洗滌2次，RPMI1640 洗 滌1 次。再 用RPMI1640 液 懸 浮PBMCs，注入T 細(xì)胞尼龍毛柱，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育4 h，沖洗出非粘附細(xì)胞即為自體T 淋巴細(xì)胞。最后用含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，調(diào)整外周血PBMCs 終濃度為2×106/L 于6 孔培養(yǎng)板內(nèi)，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)一步培養(yǎng)。

1.5 動(dòng)物分組及干預(yù)方法

SD 大鼠隨機(jī)分為5 組：正常對照組(10 只)、補(bǔ)腎解毒小劑量組(5 只，1.94 g/mL)、補(bǔ)腎解毒中劑量組 (5 只，9.71 g/mL)、健脾解毒小劑量組 (5 只，1.58 g/mL)、健脾解毒中劑量組(5 只，7.92 g/mL)。SD大鼠灌胃量按體表面積法換算，小劑量相當(dāng)于成人臨床用藥量6.562 倍[10]，其5 倍劑量為中劑量。具體灌胃干預(yù)措施及大鼠含藥血漿制備均按文獻(xiàn)[11-12]方法進(jìn)行。正常對照組采用等量生理鹽水灌胃。每天上午8：00、下午5：00 灌胃，每次灌胃量為1 mL，連續(xù)3 d，第4 天上午灌胃后1～2 h 內(nèi)取血。采血前12 h 禁食，自由飲水，1%戊巴比妥腹腔注射麻醉（45 mg/kg），待麻醉滿意后開腹，分離腹主動(dòng)脈，持采血針刺入腹主動(dòng)脈，接負(fù)壓肝素抗凝管取血，每只大鼠采血約10 mL，2 500 r/min 離心20 min，取血漿，0.22 μm 濾膜濾過除菌，將血漿分裝至1.5 mL EP 管中，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 最佳血漿培養(yǎng)濃度的確定

采用MTT 法收集分離培養(yǎng)成熟的T 細(xì)胞，用預(yù)熱的RPMI1640 培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2 次，用完全培養(yǎng)液配制成單個(gè)細(xì)胞懸液，以2×105/mL 接種96 孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，分別加入含藥血漿5、10、20 μL，使終濃度分別為5%、10%、20%，每一濃度同時(shí)設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。正常對照組大鼠血漿為正常對照孔，5%CO2、37 ℃飽和濕度孵育48 h。每孔加入20 μL(5 g／L) MTT 溶液，繼續(xù)孵育4 h，棄上清液，加入200 μL DMSO 振蕩10 min，在酶標(biāo)儀上選擇492 nm 波長，以630 nm 波長為參照波長，測定各孔吸光度值(OD 值)。選擇T 細(xì)胞生存率最高的血漿濃度作為干預(yù)濃度。T 細(xì)胞生存率=藥物干預(yù)組／正常對照組OD 值×100%。

1.7 含藥血漿干預(yù)

于培養(yǎng)第1 天收集DCs 細(xì)胞，同以上操作配制2×105/mL 單個(gè)細(xì)胞懸液。取1 mL T 細(xì)胞懸液，用于干預(yù)前T 細(xì)胞功能檢測。其余T 細(xì)胞懸液各取出1／3，分別以最佳血漿培養(yǎng)濃度的藥物血漿進(jìn)行干預(yù)，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后進(jìn)行T 細(xì)胞功能檢測。剩余1／3 T 細(xì)胞懸液加入等濃度的空白血漿作為空白血漿組。選擇OD 值最高的空白血漿濃度，即添加濃度為20%含藥血漿濃度作為計(jì)算生存率的空白血漿組的0D 值。經(jīng)計(jì)算，使T 細(xì)胞生存率最高的血漿濃度分別為10%補(bǔ)腎解毒中劑量組（96.0%）和10%健脾解毒小劑量組（95.3%）。將以上兩個(gè)濃度作為正式實(shí)驗(yàn)的干預(yù)濃度。依據(jù)目前國內(nèi)學(xué)者報(bào)道的藥物血漿最佳培養(yǎng)時(shí)間48 h 作為進(jìn)一步研究的培養(yǎng)時(shí)間[13]。

1.8 指標(biāo)檢測及方法

1.8.1 T 細(xì)胞表面分子表達(dá)檢測 取制備好的T 細(xì)胞懸液，加入l.5 mL EP 管中，分6 管，每管200 μL，分別加入熒光標(biāo)記鼠抗人CD3-Percp (多甲藻葉綠素蛋白)，CD4-FITC（異硫氰酸熒光素)，CD8-PE（藻紅蛋白熒光素），CD28-FITC 各20 μL，輕輕混勻，4 ℃孵育30 min，再用PBS 洗細(xì)胞2 次以去除未結(jié)合的游離單抗，最后以1%多聚甲醛500 μL重懸固定細(xì)胞，并用Percp、FITC、PE 標(biāo)記的鼠抗人IgG 作對照。用流式細(xì)胞儀檢測CD3+、CD4+、CD8+、CD28+的表達(dá)水平。

1.8.2 干擾素-γ（IFN-γ）的水平檢測采用ELISA 法檢測T 細(xì)胞培養(yǎng)上清液IFN-γ 水平，按試劑盒說明書操作。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料實(shí)驗(yàn)結(jié)果以 “±s” 表示，先進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，兩組間比較滿足正態(tài)性及方差齊性時(shí)用成組t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)用t＇ 檢驗(yàn)；多組間比較用方差分析，兩兩比較用q 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組各時(shí)間點(diǎn)CD3+、CD4+、CD8+以及CD28+表達(dá)比較

兩組CD3+、CD4+、CD8+以及CD28+表達(dá)較健康組均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各組健脾解毒藥物血漿與補(bǔ)腎解毒藥物血漿干預(yù)后CD3+、CD4+、CD8+以及CD28+分子表達(dá)均有升高，與干預(yù)前比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；免疫耐受組中，補(bǔ)腎解毒藥物血漿干預(yù)后CD8+及CD28+分子表達(dá)高于健脾解毒組 （P＜0.05）；兩種藥物血漿分別干預(yù)后，CD28+分子表達(dá)均高于免疫清除組同期。見表1。

表1 各組各時(shí)間點(diǎn)CD3+、CD4+、CD8+以及CD28+表達(dá)比較 （%，±s）

表1 各組各時(shí)間點(diǎn)CD3+、CD4+、CD8+以及CD28+表達(dá)比較 （%，±s）

注：與本組干預(yù)前比較*P＜0.05；與相同免疫狀態(tài)健脾解毒組比較△P＜0.05；與免疫清除組同期比較▲P＜0.05；與健康組比較▽P＜0.05。

組 別 n 劑 量(g/mL) 時(shí) 間 CD 3 CD4 CD8 CD28 免 疫 耐 受 18 干 預(yù) 前 58.05±4.40 34.45±2.55 29.62±3.11 44.36±3.43 空白血漿 18 — 干預(yù)后 57.43±2.87 32.67±3.53 29.34±4.16 44.53±3.43 補(bǔ) 腎 解 毒 18 9.71 干 預(yù) 后 64.35±2.34 39.23±3.48 34.23±2.15 52.40±2.35健 脾 解 毒 18 1.58 干 預(yù) 后 63.58±3.16 38.52±2.32 32.06±1.28 49.26±2.74 免 疫 清 除 18 干 預(yù) 前 62.29±3.60 37.34±4.16 30.82±1.98 45.76±4.31 空白血漿 18 — 干預(yù)后 61.62±2.73 36.03±3.46 29.53±4.36 45.78±3.63 補(bǔ) 腎 解 毒 18 9.71 干 預(yù) 后 64.35±2.63 40.13±2.52 32.64±3.53 48.26±2.38 健 脾 解 毒 18 1.58 干 預(yù) 后 64.26±2.37 39.37±2.34 32.78±4.21 47.32±3.23 健康 10 — 干預(yù)前 67.13±2.26 44.80±3.06 35.09±2.32 55.70±2.28

2.2 含藥血漿干預(yù)前后T 細(xì)胞分泌的IFN-γ 水平

含藥血漿干預(yù)前兩組IFN-γ 水平較健康組均偏低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；藥物血漿干預(yù)后，IFN-γ 水平較干預(yù)前均有升高（P＜0.05），兩組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組干預(yù)前后IFN-γ 水平比較 （ng/L，±s）

表2 各組干預(yù)前后IFN-γ 水平比較 （ng/L，±s）

注：與健康組比較*P＜0.05；與本組干預(yù)前比較△P＜0.05；與免疫清除組比較▲P＜0.05。

組別免疫耐受免疫清除健康n 18 18 10干預(yù)前275.64±47.32*▲286.73±43.64*334.50±43.28干預(yù)后補(bǔ)腎解毒 健脾解毒293.45±45.36△ 291.66±44.53△294.37±42.34△ 293.36±43.55△334.23±42.35 333.26±41.56

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)突破免疫耐受，清除病毒關(guān)鍵在于啟動(dòng)或激發(fā)機(jī)體特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)，而細(xì)胞免疫反應(yīng)的強(qiáng)弱與機(jī)體免疫細(xì)胞功能狀態(tài)密切相關(guān)。HBV 感染人體后，機(jī)體主要依靠細(xì)胞毒效應(yīng)與非細(xì)胞毒效應(yīng)兩種免疫機(jī)制清除病毒，其中T 淋巴細(xì)胞參與的細(xì)胞毒效應(yīng)起主要作用。機(jī)體的特異性細(xì)胞免疫包括CD8+細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞(CTL)和CD4+輔助性T 淋巴細(xì)胞(Th)。CD4+T 淋巴細(xì)胞是機(jī)體抗病毒免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)，其數(shù)量的下降可直接影響免疫調(diào)節(jié)功能，造成宿主體液免疫和細(xì)胞免疫缺陷，最終導(dǎo)致患者體內(nèi)HBV 清除緩慢而不徹底[14]。CD8+T 淋巴細(xì)胞有直接被HBV 感染的肝細(xì)胞激活的特性，作為免疫應(yīng)答損害被感染的肝細(xì)胞，同時(shí)也清除病毒。因此，HBV 感染患者T 淋巴細(xì)胞亞群CD4+和CD8+是反映機(jī)體免疫狀態(tài)和功能的重要指標(biāo)，對HBV 的感染及乙肝的慢性化有重要意義，在一定程度上可以反映機(jī)體細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能。此外，CD28+是T 淋巴細(xì)胞表面重要的共刺激分子，它參與T 細(xì)胞活化信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，使T 細(xì)胞活化、增殖、啟動(dòng)和維持免疫應(yīng)答。因此，它對于誘導(dǎo)和維持T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答具有十分重要作用[15-16]。

慢性HBV 感染屬中醫(yī)學(xué) “黃疸”、“脅痛”、“臌脹”、“積聚”等范疇，其外因是濕熱疫毒內(nèi)侵，內(nèi)因歸屬脾腎二臟虧虛[5]。病理基礎(chǔ)屬于本虛標(biāo)實(shí)，在正邪斗爭的過程中，機(jī)體的免疫功能處于紊亂狀態(tài)，正氣虧虛不能完全行使清除邪氣(HBV)的功能，病理狀態(tài)得不到修復(fù)，致使疾病纏綿難愈。標(biāo)本兼治符合慢性HBV 感染病因病機(jī)，本實(shí)驗(yàn)采用補(bǔ)腎解毒方和健脾解毒方干預(yù)HBV 慢性感染患者外周血T 淋巴細(xì)胞，探討兩種治法對HBV 慢性感染不同狀態(tài)T淋巴細(xì)胞功能的影響，不僅有利于進(jìn)一步明確慢性HBV 感染患者發(fā)病的中醫(yī)臟腑病機(jī)，而且為臨床治療慢性HBV 感染患者提供科學(xué)可靠的治療思路和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)，免疫耐受組與免疫清除組兩組CD3+、CD4+、CD8+以及CD28+表達(dá)較健康組均下降，說明慢性HBV 感染患者機(jī)體T 淋巴細(xì)胞表達(dá)低下，存在免疫功能缺陷或不足。各組健脾解毒藥物血漿與補(bǔ)腎解毒藥物血漿干預(yù)后CD3+、CD4+、CD8+以及CD28+分子表達(dá)均有升高，而免疫耐受組中，補(bǔ)腎解毒藥物血漿干預(yù)后CD8+及CD28+分子表達(dá)高于健脾解毒組，同時(shí)兩種藥物血漿分別干預(yù)后，CD28+分子表達(dá)均高于免疫清除組同期。此外，含藥血漿干預(yù)前兩組IFN-γ 水平較健康組均偏低，而藥物血漿干預(yù)后，IFN-γ 水平較干預(yù)前均有升高。由此證實(shí)兩種藥物血漿干預(yù)均能促進(jìn)T 淋巴細(xì)胞表面分子的表達(dá)，通過補(bǔ)腎解毒方與健脾解毒方在一定程度上可以促進(jìn)機(jī)體免疫功能的改善或恢復(fù)，并且補(bǔ)腎解毒方藥物血漿更能促進(jìn)T 淋巴細(xì)胞的表達(dá)，為今后慢性HBV 感染的臨床治療提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)與方向。本實(shí)驗(yàn)只選取了一些指標(biāo)進(jìn)行觀察，且樣本量有限，不能全面反映慢性HBV 感染患者機(jī)體免疫功能狀態(tài)，且未做臨床多中心研究，有待在今后的實(shí)驗(yàn)和臨床中進(jìn)一步完善。

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