申可佳，熊 桀，尤昭玲，雷 磊，邱苒苒，游 卉，付靈梅

（1 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙410208；2 湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬一醫(yī)院，湖南 長沙410208）

卵巢內(nèi)顆粒細(xì)胞-卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞-卵泡膜細(xì)胞的信號(hào)交流是卵母細(xì)胞發(fā)育成熟的重要條件，顆粒細(xì)胞及卵泡膜細(xì)胞的生長或凋亡對(duì)卵泡發(fā)育及卵母細(xì)胞的質(zhì)量起著舉足輕重的作用。我們的前期工作發(fā)現(xiàn)護(hù)卵湯能改善促性腺激素釋放激素（GnRHa）超排卵大鼠的卵泡發(fā)育及卵子質(zhì)量，影響體內(nèi)生殖激素水平[1-2]，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察護(hù)卵湯對(duì)GnRHa 超排卵大鼠卵巢細(xì)胞凋亡及妊娠結(jié)局的影響?，F(xiàn)將實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康8 周齡SPF 級(jí)雌性SD 大鼠90只，體質(zhì)量為180～220 g。第3 周購入成年雄性大鼠20 只。以上動(dòng)物均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格許可證號(hào)：SCXK（湘）2009-0004。

1.1.2 藥物 護(hù)卵湯顆粒，由廣東一方制藥有限公司生產(chǎn)提供，每劑的總質(zhì)量為17.1 g，相當(dāng)于生藥量116 g（熟地黃10 g，生地黃10 g，沙參10 g，石斛10 g，山藥10 g，蓮子肉10 g，桑椹子10 g，覆盆子10 g，菟絲子10 g，月季花10 g，蓮心3 g，肉蓯蓉10 g，甘草3 g）；注射用促性腺激素釋放激素（Gn-RHa）：馬鞍山豐原制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)1005265；注射用尿促性腺激素（HMG）：中國麗珠集團(tuán)麗寶生物化學(xué)制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)1007234；注射用絨毛膜促性腺激素（HCG）：中國麗珠集團(tuán)麗寶生物化學(xué)制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)1006137。

1.1.3 試劑 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，4%多聚甲醛，磷酸鹽緩沖液（PBS），蒸餾水，雙氧水（H2O2），SABC染色液，DAB 顯色液，蘇木素，25%烏拉坦等，購自武漢Boster 公司、湖南麗欣生物有限公司或自己配制。

1.1.4 儀器 光學(xué)顯微鏡（日本Olympus）；石蠟切片機(jī)（英國Shandon325）；Motic B5 顯微圖像攝相系統(tǒng)（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司）；圖像分析軟件（美國Image-Pro Plus 6.0）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥方法 將大鼠隨機(jī)分為5組：正常組，模型組，護(hù)卵湯低、中、高劑量組，各組給予正常喂養(yǎng)，均在每天上午7:30～8:30 行陰道涂片、染色及鏡檢。各組雌鼠均在陰道涂片發(fā)現(xiàn)進(jìn)入動(dòng)情后期當(dāng)天開始用藥[1]。大鼠用藥劑量參照徐叔云等[3]方法，按70 kg 成人體表面積換算。其中模型組模仿人類GnRHa 長方案建立超排卵大鼠模型（從動(dòng)情后期當(dāng)天開始，每天腹腔注射GnRHa 2.7 μg/200 g，連續(xù)注射9 d，第9 天同時(shí)注射HMG 4.1 IU/200 g 1 次，48 h 后注射HCG 180 IU/200 g 1 次）；護(hù)卵湯各劑量組在模型組基礎(chǔ)上加用不同劑量的護(hù)卵湯（低、中、高劑量組從動(dòng)情后期當(dāng)天開始至第11 天，每天上午分別給予護(hù)卵湯1.6、3.1、6.2 g/kg 灌胃），模型組、正常組每天在相應(yīng)時(shí)間給予等量生理鹽水腹腔注射和灌胃。

1.2.2 標(biāo)本采集 在注射HCG 后4 h 用25%烏拉坦麻醉大鼠，動(dòng)物天平稱體質(zhì)量后固定于鼠板，剪開大鼠腹膜，沿雙側(cè)子宮角上行，分別找到雙側(cè)卵巢，摘取雙側(cè)卵巢并去除表面脂肪組織。每組余下的雌鼠在注射HCG 后當(dāng)天與雄鼠以2∶1 比例合籠過夜，次日早晨7∶00 檢查雌鼠，若發(fā)現(xiàn)陰栓或陰道分泌物涂片中有精子記為孕1 d，常規(guī)飼養(yǎng)至孕12 d，用25%烏拉坦麻醉后固定于鼠板，剪開大鼠腹膜，取出雙側(cè)子宮，計(jì)數(shù)宮內(nèi)活胎數(shù)和總胎數(shù)，計(jì)算每組妊娠大鼠的總活胎率=[總活胎數(shù)/總胎數(shù)]×100%。

1.2.3 卵巢細(xì)胞凋亡檢測(cè) 將取出的卵巢組織按TUNEL 法進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)操作，置于顯微鏡下觀察，細(xì)胞核有棕黃色顆粒者為凋亡細(xì)胞，未凋亡細(xì)胞呈藍(lán)色。使用圖像分析軟件觀察結(jié)果，隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（400 倍），計(jì)數(shù)200 個(gè)細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算細(xì)胞凋亡率[4]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HCG 注射后當(dāng)日各組大鼠卵巢細(xì)胞凋亡率

模型組及護(hù)卵湯各劑量組的卵巢體細(xì)胞凋亡率比正常組顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。護(hù)卵湯各劑量組的卵巢體細(xì)胞凋亡率均比模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01 或0.05）。結(jié)果見表1及圖1。

表1 HCG日各組大鼠卵巢體細(xì)胞凋亡率 （n=8，±s）

表1 HCG日各組大鼠卵巢體細(xì)胞凋亡率 （n=8，±s）

注：與模型組比較★P＜0.05，★★P＜0.01；與正常組比較▲▲P＜0.01。

組 別正常組模型組護(hù)卵湯低劑量組護(hù)卵湯中劑量組護(hù)卵湯高劑量組藥物劑量（g／kg）--1.6 3.1 6.2凋亡率（%）5.50±1.10 16.75±3.06▲▲13.13±2.95★▲▲12.56±2.69★▲▲11.13±2.80★★▲▲

2.2 孕12 d 妊娠大鼠的總活胎率

孕12 d 各組妊娠大鼠的總活胎率如表2所示，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各組之間的數(shù)據(jù)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 孕12 d 各組大鼠妊娠總活胎率比較

圖1 各組大鼠卵巢細(xì)胞凋亡光鏡圖（TUNEL ×400）

3 討論

細(xì)胞凋亡（apoptosis）是在特定信號(hào)的誘導(dǎo)下，一系列基因按程序時(shí)空順序表達(dá)，引起細(xì)胞內(nèi)死亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致自主性程序性的細(xì)胞死亡。在成人的卵巢組織，細(xì)胞凋亡發(fā)生在閉鎖卵泡或發(fā)育異常的卵泡，正常健康的卵泡不會(huì)觀察到細(xì)胞凋亡現(xiàn)象；且細(xì)胞凋亡首先發(fā)生在顆粒細(xì)胞中，隨后也出現(xiàn)于膜細(xì)胞層中，其主要累及的是卵巢顆粒細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞而非卵母細(xì)胞[6]。由于細(xì)胞凋亡早期就有DNA斷裂，故TUNEL 法可以檢測(cè)到早期的細(xì)胞凋亡，本實(shí)驗(yàn)采用TUNEL 法檢測(cè)卵巢體細(xì)胞凋亡，具有靈敏度高、操作簡單快速、觀察方便（可用光學(xué)顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果）等優(yōu)點(diǎn)。多項(xiàng)研究表明[7-12]，卵泡顆粒細(xì)胞凋亡率與卵母細(xì)胞的質(zhì)量及胚胎的體外發(fā)育潛能相關(guān)，與IVF 獲卵數(shù)、受精率及妊娠結(jié)局相關(guān)，超排卵周期增高的卵泡顆粒細(xì)胞凋亡率會(huì)影響卵子質(zhì)量及妊娠率。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組及護(hù)卵湯各劑量組大鼠的卵巢體細(xì)胞凋亡率比正常組顯著增高，證實(shí)超排卵周期卵巢體細(xì)胞凋亡率較自然周期增高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，并且是導(dǎo)致模型組大鼠排卵前優(yōu)質(zhì)卵泡率較正常組下降、卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)異常[1]的原因。而護(hù)卵湯各劑量組均能有效減少GnRHa 超排卵大鼠卵巢體細(xì)胞的凋亡，這提示中藥護(hù)卵湯參與GnRHa 超排卵治療，能促進(jìn)卵泡發(fā)育及提高卵母細(xì)胞的質(zhì)量，與前期結(jié)果相符[1]。觀察孕12 d 各組妊娠大鼠的總活胎率發(fā)現(xiàn)，模型組的總活胎率低于其它各組，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各組之間活胎率差異性不顯著可能與樣本量偏小有關(guān)，在下一步的實(shí)驗(yàn)中增加樣本例數(shù)應(yīng)該更能說明護(hù)卵湯對(duì)各組大鼠活胎率的影響

綜合本次實(shí)驗(yàn)和前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得出結(jié)論：GnRHa 超排卵增加大鼠卵巢體細(xì)胞凋亡，對(duì)卵泡發(fā)育有不利影響；而護(hù)卵湯能減少GnRHa 超排卵大鼠卵巢體細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)卵泡發(fā)育及提高卵母細(xì)胞的質(zhì)量。

［1］申可佳，尤昭玲，熊 桀，等.護(hù)卵湯對(duì)GnRHa 超排卵大鼠卵巢形態(tài)的影響［J］.湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，32（9）：25-28.

［2］申可佳，熊 桀，尤昭玲，等.護(hù)卵湯對(duì)GnRHa 超排卵大鼠血清生殖激素的影響［J］.湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，32（12）：

［3］徐叔云，卞如濂，陳 修，等.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出社，1982：1 184.

［4］王 玲.從調(diào)節(jié)卵巢細(xì)胞凋亡探討左歸丸治療免疫性卵巢早衰的機(jī)制［D］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2007.

［5］丁 峰，陳士嶺，邢福祺.卵泡閉鎖調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展［J］.國外醫(yī)學(xué)·遺傳學(xué)分冊(cè)，1999，22（2）：88-91.

［6］Ana Clavero，Jose A Castillab，Ana I Nunez.Apoptosis in human granulose cells after induction of ovulation in women participating in an intracytoplasmic sperm injection program ［J］.Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology，2003，110：181-185.

［7］Hutt K J，E A MeLanghlin，M K Holland.Kit ligand and c-Kit have diverse roles during mammalian oogenesis and folliculogenesis［J］.Mol Hum Reprod，2006，12（2）：61-69.

［8］Corn C M，Hauser-Kronberger C，Moser M，et al.Predictive value of cumulus cell apoptosis with regard to blastocyst development of corresponding gametes ［J］.Fertil Steril，2005，84（3）：627-633.

［9］Lee K S，Joo B S，Na Y J，et al.Cumulus cells apoptosis as an indicator to predict the quality of oocytes and the outcome of IVF-ET ［J］.Assist Reprod Genet，2001，18（9）：490-498.

［10］王國云，姜 虹，晃 嵐，等.人卵丘顆粒細(xì)胞凋亡與卵子發(fā)育潛能關(guān)系的研究［J］.生殖與避孕，2006，26（2）：91-94.

［11］劉 景.顆粒細(xì)胞MDA、SOD 水平和凋亡率對(duì)卵子質(zhì)量和IVF-ET 結(jié)局的影響［D］.中南大學(xué)，2008.