吳 濤，王 嘉，林 健，毛婭卿，韓春華，王 哲，潘 潔，孔冬妮，蔣桃珍*，劉月煥*

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081;2.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京100097)

馬流感(ED quine influenza)是由正粘病毒科流感病毒屬A型流感病毒引起的馬、驢、騾等動物的一種急性暴發(fā)式呼吸道傳染病[1]。自然條件下，只有馬屬動物易感。病馬主要表現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽和流漿液性鼻液，并可通過繼發(fā)感染其他病原菌而導(dǎo)致病情加重或者死亡，懷孕母馬還可發(fā)生流產(chǎn)[2-3]。馬流感病毒包括2個亞型，分別為H7N7(馬1型)和H3N8(馬2型)[4]。建國后，我國共有4次馬流感大流行，除發(fā)生于1974年的第一次流行為H7N7亞型外，至2007年的其他3次大流行均屬于H3N8亞型[5]。本文通過臨床癥狀觀察、病毒分離及HI抗體檢測等指標研究了分離的H3N8亞型馬流感病毒(Huabei株)[6]對馬的感染情況及致病性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 H3N8亞型馬流感病毒(A/Equine/Huabei/1/2007，簡稱 Huabei株)E2、E3、E4、E5、E10代病毒液由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所和中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所分離、鑒定。

1.1.2 實驗動物 12匹12月～4歲蒙古馬(馬流感病毒H3亞型HI抗體陰性)購于內(nèi)蒙古錫林浩特市正藍旗渾善達克沙地;2匹8歲騾(馬流感病毒H3亞型HI抗體陰性)購于內(nèi)蒙古化德縣;10日齡SPF雞胚購于北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要試劑 受體破壞酶(RDE)由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病所國家流感中心提供;馬流感H3亞型HI抗原與陰、陽性血清由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所和中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備。

1.2 方法

1.2.1 病毒液的制備 將104倍稀釋的E1代病毒經(jīng)尿囊腔途徑接種10日齡SPF雞胚，孵化60～72 h，收獲雞胚尿囊液。按照同樣的稀釋倍數(shù)和接種方法進行傳代，傳至E10代。測定E2、E3、E4、E5和E10代馬流感病毒(Huabei株)對雞胚的半數(shù)感染量，試驗用各代次病毒的雞胚半數(shù)感染量見表1。

表1 試驗設(shè)計與分組

1.2.2 動物感染實驗 12匹蒙古馬和2匹騾編號后按照試驗時間的先后隨機分為5組(試驗分組、感染劑量等詳細情況見表1)，將各代次病毒原液分別裝入噴霧接種瓶中，在試驗馬的兩側(cè)眼睛和鼻孔進行噴霧感染，每匹5 mL。感染后，置負壓動物舍，每組實驗馬隔離飼養(yǎng)。每天定時觀察實驗馬的臨床癥狀，上下午各2次，記錄臨床癥狀，同時感染后每天上下午定時測定體溫。

1.2.3 病毒分離 分別于感染后3、4、5、6、7 d采集鼻咽拭子，每匹馬采集2個棉拭子，一起放于裝有1.0 mL TPB(含10000單位青、鏈霉素)的離心管中，經(jīng)振蕩、離心后，取上清液，經(jīng)尿囊腔途徑接種5枚10日齡SPF雞胚。孵育觀察72 h，測定所有雞胚HA效價。每份混合拭子樣品接種的雞胚中只要有1枚雞胚的尿囊液HA效價≥1∶16，即判為病毒分離陽性。

1.2.4 HI抗體檢測 感染后14 d，采集所有試驗馬的血液，分離血清，按照《OIE陸生動物診斷試驗和疫苗手冊(哺乳動物、禽鳥與蜜蜂)》[4]中介紹的方法測定病毒感染后馬體內(nèi)的HI抗體，HI效價大于等于1∶20時判為陽性。

2 結(jié)果

2.1 體溫變化 第1組的4匹馬和2匹騾于接種病毒后2 d均出現(xiàn)明顯的體溫升高，日平均體溫最高達42.6℃和41.4℃，且持續(xù)期為8 d;第2組的兩匹馬也于感染后2 d出現(xiàn)明顯的體溫升高，日平均體溫最高達39.8℃，發(fā)熱持續(xù)時間為5 d;第3組的兩匹馬于感染后2 d均出現(xiàn)體溫升高，日平均最高體溫為39.0℃，僅持續(xù)3 d時間;第4組和5組的4匹馬體溫正常，平均體溫分別為38.0℃和38.2℃，詳細結(jié)果見圖1和表2。

圖1 5代Huabei株馬流感病毒感染后實驗動物的體溫變化

2.2 臨床癥狀 第1組(E2代毒)的4匹馬和2匹騾接種后2 d均出現(xiàn)精神沉郁，雙側(cè)鼻孔流漿液性鼻液和膿性分泌物，1～3號馬出現(xiàn)輕度的咳嗽，其中3號馬出現(xiàn)呼吸困難，并且持續(xù)5 d;第2組的兩匹馬在感染后3 d出現(xiàn)輕度咳嗽，并持續(xù)2 d，雙側(cè)鼻孔流出清亮的漿液性鼻液，其中1批馬于感染后5 d鼻孔流出膿性分泌物;第3組的2匹試驗馬于感染后2 d雙側(cè)鼻孔均有漿液性鼻液流出，感染后3 d鼻液的量較多，持續(xù)2 d，其中1匹馬出現(xiàn)呼吸急促;第4組和第5組的4匹馬于感染后2 d雙側(cè)鼻孔均出現(xiàn)流漿液性鼻液，持續(xù)2 d，沒有出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難，結(jié)果見表2。

表2 H3N8亞型馬流感病毒感染后馬的臨床癥狀和病原學(xué)檢測結(jié)果

2.3 病毒分離 感染后3～6 d，5組12匹馬和2匹騾病毒分離都為陽性;感染后7 d，第2組2匹馬病毒分離為陰性，其余組馬匹病毒分離為陽性。結(jié)果見表2。

2.4 馬流感病毒 H3亞型HI抗體接種5代H3N8亞型馬流感病毒后14 d，5組試驗中12匹馬和2匹騾的HI抗體效價均明顯升高。結(jié)果見表2。

3 討論與結(jié)論

為驗證馬流感病毒Huabei株對其他馬屬動物的易感性，選擇了2匹馬流感HI抗體陰性的成年騾用于試驗，目前國內(nèi)尚未見有H3N8亞型馬流感病毒感染騾進行試驗的相關(guān)報道。試驗安排在負壓動物舍內(nèi)進行，溫度恒定在21.0～23.0℃。在沒有冷應(yīng)激和繼發(fā)感染存在的前提下，第1組4匹馬和2匹騾在E2代病毒接種2 d后出現(xiàn)了持續(xù)性發(fā)熱和流漿液性鼻液的癥狀，這是馬流感典型臨床表現(xiàn)，說明馬流感病毒Huabei株對馬和騾等馬屬動物同樣易感。但成年騾與同組12～18個月齡的試驗馬匹咳嗽、呼吸困難等臨床表現(xiàn)并不一致，這可能與實驗用動物的種屬、年齡和個體差異(體質(zhì)和上呼吸道寄生的病原體)有關(guān)，還需要進一步試驗驗證。

試驗中將5個不同代次H3N8亞型馬流感病毒Huabei株以107.2～107.4EID50的劑量通過噴霧方式經(jīng)眼和鼻腔途徑感染馬和騾，14 d后5組試驗12匹馬和2匹騾血清學(xué)反應(yīng)均為陽性，表明試驗用5個代次的H3N8亞型馬流感病毒均可以感染馬和騾。但不同代次毒感染后出現(xiàn)的臨床癥狀有很大的區(qū)別，代次越高臨床癥狀越不明顯。國外也有文獻報道[7]，馬流感病毒人工感染發(fā)病模型的建立過程中，可能由于毒株的選擇、毒株通過雞胚的傳代次數(shù)不同、實驗動物、感染途徑和感染劑量的不同而導(dǎo)致不同的實驗結(jié)果。本研究結(jié)果證實了馬流感病毒Huabei株致病性與雞胚傳代有關(guān)，隨著雞胚傳代的增加，病毒對馬的致病性明顯降低，不同代次雞胚毒致病力改變的分子機制需要進一步研究和探討。

試驗表明，E2、E3代病毒以107.2～107.4EID50劑量經(jīng)噴霧途徑感染可使12～18個月齡的馬匹出現(xiàn)持續(xù)性發(fā)熱和流鼻液的典型馬流感癥狀。本研究成功建立了馬流感病毒Huabei株的感染發(fā)病模型，確定了感染劑量及代次，為馬流感疫苗效果評價奠定了試驗基礎(chǔ)。

[1]Wilson W D.Equine influenza[J].Vet Clin North Am Equine Pract，1993，9(2):257-282.

[2]Sovinova O，Tumova B，Pouska F，et al.Isolation of a virus causing respiratory disease in horses[J].ActaVirol，1958，2:52-61.

[3]Wadell H，Teigland B，Sigel M.A new influenza virus associated with equine respiratory disease[J].J Am Vet Assoc，1963，143:587-590.

[4]世界動物衛(wèi)生組織.OIE陸生動物診斷試驗和疫苗手冊(哺乳動物、禽鳥與蜜蜂)[M].農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局/中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心譯.北京.2007:622-626.

[5]郭 巍，閆 妍，王英原，等.新疆地區(qū)一株馬流感病毒的分離及鑒定[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2008，30(8):586-591.

[6]蔣桃珍，劉月煥，林 健，等.2007年華北地區(qū)H3N8亞型馬流感病毒的分離與鑒定[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2010，30(5):607-611.

[7]Jennifer A，Mumford D，Hannant，et a1.Experimental infection of ponies with equine influenza(H3N8)viruses by intranasal inoculations or exposure to aerosols[J].Equine Vet J，1990，22(2):93-98.