李毅竦，崔艷莉，楊武寧，孫舒放，覃雪斌，何 瓊

(廣西獸藥監(jiān)察所，南寧530001)

穿白痢康丸是《中華人民共和國(guó)獸藥典》二○一○年版收載的新制劑，穿心蓮是主藥但質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)無(wú)含量測(cè)定[1]。穿心蓮藥材中主要有效成分為穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯，以葉子含量多，葉子中又以嫩葉多，中老葉有逐漸減少趨勢(shì)[2];商品穿心蓮藥材在采收、曬干、包裝、運(yùn)輸和貯存過(guò)程中葉片被大量丟失損耗，穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯是欠穩(wěn)定的化合物，藥材久置后含量會(huì)降低，制劑生產(chǎn)受熱的工藝中損失也較多[3]。為了能夠測(cè)定穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量，保證制劑質(zhì)量，實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)穿白痢康丸中穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯含量測(cè)定方法進(jìn)行了研究。

1 材料

1.1 儀器 島津LC20型系列高效液相色譜儀(SPD-20A紫外檢測(cè)器，LCSOLUTION色譜工作站，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱);AG 245型電子天平;KQ-250 DB超聲波儀。

1.2 供試藥品與試劑 10批次穿白痢康丸(廣西三家藥廠提供)，陰性對(duì)照樣品(缺穿心蓮的穿白痢康丸)按《中華人民共和國(guó)獸藥典》2010年版收載的穿白痢康丸標(biāo)準(zhǔn)的處方(去穿心蓮)和制法自制;供含量測(cè)定用穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品(批號(hào)110797-201108，含量98.7%)和脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品(批號(hào)110854-201007，含量99.7%)由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供;層析用中性氧化鋁、流動(dòng)相中甲醇為色譜純、水為超純水;其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:lnertsil?ODS-SP(250 mm ×4.6 mm ，5 μm)Column;流動(dòng)相:甲醇 -水(52:48);檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm;流速1.0 mL/min;柱溫30℃;進(jìn)樣量:10 μL。

2.2 供試品溶液的制備 取本品研細(xì)，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞稱定重量，冷浸30 min，超聲處理(功率250 W頻率40 KHZ)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液10 mL，置中性氧化鋁柱(200-300目，5 g，內(nèi)徑為1.5 cm)上，用甲醇15 mL洗脫，收集洗脫液，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，經(jīng)微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，即得。

2.3 對(duì)照品與陰性溶液的制備 取穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品約15 mg，脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品約10 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度作為貯備液。精密吸取貯備液5 mL置25 mL量瓶中加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL含穿心蓮內(nèi)酯30 μg，脫水穿心蓮內(nèi)酯20 μg的對(duì)照品溶液。取自制陰性對(duì)照樣品，按2.2“供試品溶液的制備”方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖(圖1-圖3)，從供試品色譜圖可以看出，在上述色譜條件下，理論塔板數(shù)按脫水穿心蓮內(nèi)酯峰計(jì)大于2000，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，有相同保留時(shí)間(穿心蓮內(nèi)酯6.9 min;脫水穿心蓮內(nèi)酯16.9 min)的色譜峰，穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯與相鄰共存物之間的分離度分別為3.1和17.5(藥典要求應(yīng)大于1.5)，陰性對(duì)照在穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯相同保留時(shí)間處無(wú)干擾峰。

圖1 穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品混合液HPLC色譜圖

圖2 穿白痢康丸樣品HPLC色譜圖

圖3 穿白痢康丸陰性對(duì)照樣品HPLC色譜圖

2.5 線性范圍考察 分別精密稱取穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品15 mg，脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品10 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液。分別精密吸取對(duì)照品貯備液1，5，10，15，20 mL，置 25 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，吸取10 μL，注入高效液相色譜儀，以上述色譜條件測(cè)定峰面積。以對(duì)照品濃度作為橫坐標(biāo)(X)，峰面積作為縱坐標(biāo)(Y)，得線性回歸方程:穿心蓮內(nèi)酯 Y=37105X-19283，r=0．9996;脫水穿心蓮內(nèi)酯Y=31264X-16722，r=0.9999。結(jié)果表明，穿心蓮內(nèi)酯在0.06～1.2 μg、脫水穿心蓮內(nèi)酯在0.04～0.80 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取同一份對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯RSD分別為0.46%和0.28%，表示儀器精密度良好，可以滿足含量測(cè)定的要求。

2.7 穩(wěn)定性與重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品(批號(hào)130101)，按上述色譜條件分別在 0、1、2、4、8、24 h進(jìn)樣10μL，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積，穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯 RSD分別為0.83%和0.95%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)測(cè)定值基本穩(wěn)定。另平行稱取供試品6份，按照樣品含量測(cè)定項(xiàng)下的方法測(cè)定，穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量RSD分別為0.88%和0.56%，表明重復(fù)性良好。

2.8 系統(tǒng)耐用性實(shí)驗(yàn) 對(duì)同一批供試品(批號(hào):130101)分別用 Symmetry?C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、watersC18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)、lnertsil?ODS-SP(250 mm × 4.6 mm，5 μm)的色譜柱，流動(dòng)相甲醇-水(55∶45)、甲醇-水(52∶48)，穿心蓮內(nèi)酯檢測(cè)波長(zhǎng)225 nm、脫水穿心蓮內(nèi)酯檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，240 nm波長(zhǎng)同時(shí)測(cè)定穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯等不同的因素試驗(yàn)，用相對(duì)平均偏差(計(jì)算公式:平均偏差除以平均值)比較上述條件的測(cè)定數(shù)值與標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定方法測(cè)定數(shù)據(jù)，結(jié)果相對(duì)平均偏差為0.96%，表示受測(cè)定條件的小變動(dòng)影響有限，能通過(guò)本系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。

2.9 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收試驗(yàn)法，取同一批已知含量的穿白痢康丸(批號(hào):130101)分別加一定量的穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品，按上述色譜條件測(cè)定，用公式:回收率%=C-A/B×100%(C:為加入對(duì)照品后的測(cè)得總量，A:樣品中所含被測(cè)成分量，B:加入對(duì)照品量)計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率測(cè)定結(jié)果(n=9)

2.10 樣品含量測(cè)定 取穿白痢康丸(10個(gè)批次)按2.2“供試品溶液的制備”的方法操作，分別精密吸取供試品溶液與上述的對(duì)照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定10批次樣品穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯中峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算其含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論與結(jié)論

蔡松濤等[4]認(rèn)為在穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯含量測(cè)定的前處理，超聲提取優(yōu)于熱回流法，甲醇提取效率最高。通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，氧化鋁5 g，柱子內(nèi)徑1.5 cm，凈化10 mL的供試液，用15 mL甲醇洗脫，能達(dá)到既能吸附雜質(zhì)，又能完全洗脫穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯供檢測(cè)。超聲提取時(shí)間選用30 min能提取完全[5-7]，因此，實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)方法優(yōu)選，采用婦科千金片甲醇超聲提取法，以及穿心蓮藥材[8]的過(guò)柱凈化方法。

表2 10批次樣品含量測(cè)定結(jié)果 (mg/g)

HPLC法測(cè)定復(fù)方制劑中的穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯，文獻(xiàn)多參照《中華人民共和國(guó)藥典》二○一○年版的穿心蓮藥材測(cè)定穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯含量的流動(dòng)相(甲醇/水，52/48)和測(cè)定波長(zhǎng)(穿心蓮內(nèi)酯 225 nm，脫水穿心蓮內(nèi)酯254 nm)[8]，掃描有最大吸收[9-10]，通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)，本試驗(yàn)最終采用流動(dòng)相為甲醇 -水(52/48)，用240 nm波長(zhǎng)同時(shí)測(cè)定穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量[8]，取得了較好的效果。

本研究仿婦科千金片[8]以二者的總量作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的限量。供試品的穿心蓮內(nèi)酯含量為脫水穿心蓮內(nèi)酯3倍，與文獻(xiàn)報(bào)道[11]相符。穿白痢康丸為水丸，在泛丸中不可避免的熱處理，會(huì)導(dǎo)致穿心蓮內(nèi)酯損失和部分轉(zhuǎn)化為脫水穿心蓮內(nèi)酯，二者含量變化是動(dòng)態(tài)的，也是不可控的。因此，以穿心蓮內(nèi)酯與脫水穿心蓮內(nèi)酯的總量來(lái)控制產(chǎn)品質(zhì)量較單控制其中一種成分更為科學(xué)、合理[11]，10批樣品的穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯總量最高為3.9 mg/g，最低為 3.6 mg/g，平均為 3.7 mg/g?？紤]到不同產(chǎn)地、不同采收季節(jié)的穿心蓮藥材中穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量差別較大[9]，從穿心蓮藥材的采收到制劑成品生產(chǎn)鏈中穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量諸多不穩(wěn)定的因素，參照中藥口服復(fù)方制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂方法，擬定穿白痢康丸的穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯總量限度為10批樣品平均量的80%為標(biāo)準(zhǔn)的控制量，即每1 g含穿心蓮以穿心蓮內(nèi)酯(C20H30O5)、脫水穿心蓮內(nèi)酯(C20H28O4)的總量計(jì)，不得少于3.0 mg。

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