王欣，許宏賢，周鵬，段鋼

(杰能科(中國)生物工程有限公司，江蘇 無錫，214028)

賴氨酸是人和動物所必須的且自身不能合成的一種氨基酸，是目前全球使用量最大的氨基酸類飼料添加劑，約90%被用作飼料添加劑，約5%用作食品添加劑，其余5%用作醫(yī)藥中間體［1］。

直接發(fā)酵法是目前廣泛采用的賴氨酸生產方法，目前國內使用該法生產賴氨酸的企業(yè)有長春大成集團、聊城希杰、寧夏伊品、山東金玉米、梅花集團、安徽豐原生化等，其中長春大成集團的賴氨酸生產能力已經居于世界前列。國外生產賴氨酸的企業(yè)主要有美國ADM公司、德國的Evonik和韓國希杰公司。工業(yè)生產中最高產酸率已經提高到180 g/L左右，提取收率也達到90%左右，用于工業(yè)大生產的菌株多為谷氨酸棒桿菌、黃色短桿菌、乳糖發(fā)酵桿菌等桿菌及其突變株［2］。

在賴氨酸生產中，能夠作為碳源的物質很多，有淀粉、糖蜜、葡萄糖、醋酸、苯甲酸、乙醇和烴類等，但是目前實現(xiàn)產業(yè)化的只有糖蜜、淀粉和醋酸3種原料路線。中國大部分生產企業(yè)都用玉米淀粉作為原料，而隨著玉米深加工業(yè)的迅速發(fā)展，玉米價格也一路上揚，并且國家發(fā)改委也對玉米深加工業(yè)進行了調整，提出了合理控制工業(yè)用玉米量增加的要求，這也對氨基酸生產企業(yè)造成了一定的壓力［3］。對于工業(yè)氨基酸的生產，原料成本是影響整個企業(yè)成本的關鍵，約占50%以上，所以通過各種形式的拓展原料的方法都已經在研究中，比如通過代謝工程的方法尋找更廉價的原料，或者提高原料利用率和轉化率。下面以谷氨酸棒桿菌為例，對于各種原料的代謝利用和目前比較關注的改進方向進行了闡述。

1 淀粉糖原料的代謝

1.1 葡萄糖

用發(fā)酵法生產賴氨酸，目前國內大部分企業(yè)是以玉米淀粉糖化液做原料，而糖化液中95%以上是葡萄糖。葡萄糖的吸收主要依靠PTS(phosphoenol pyruvate transferase system)轉運系統(tǒng)(圖1)，該系統(tǒng)利用兩種通常共享的胞質蛋白的組合——磷酸烯醇式丙酮酸依賴性蛋白激酶EI和HPr，它們和離散的膜結合EII蛋白復合物相互作用，EII分別被稱為果糖-pts、蔗糖-pts和葡萄糖-pts，它們分別優(yōu)先轉運果糖、蔗糖和葡萄糖［4］。事實上，在谷氨酸棒桿菌中對于葡萄糖的轉運除了PTS途徑之外還保留著另外一種轉運途徑IMglu［5］，此轉運系統(tǒng)中肌醇透性Iol T1和Iol T2起著十分重要的作用，而培養(yǎng)基中的肌醇會誘導谷氨酸棒桿菌中IoI T1和IoI T2的表達。Lindner研究表明，在敲除了谷氨酸棒桿菌中PTS途徑中HPr的編碼基因之后，iol T1/iol T2和葡萄糖激酶的編碼基因ppgK的過表達就能夠提高賴氨酸的產量10% ～20%［6］。

圖1 糖類的PTS轉運系統(tǒng)Fig.1 Sugars uptake PTS system

通過PTS轉運系統(tǒng)，葡萄糖進入細胞內并且磷酸化為6-磷酸-葡萄糖。一部分進入PPP途徑生產足夠的NADPH供賴氨酸合成使用，一部分進入TCA循環(huán)，在谷氨酸棒桿菌中，賴氨酸是由天冬氨酸經α，ε-二氨基庚二酸途徑合成，合成途徑如圖2所示。

圖2 賴氨酸合成途徑Fig.2 Lysine synthesis pathway

可以看出，合成賴氨酸必須供應足夠的NADPH，谷氨酸棒桿菌利用1 mol丙酮酸、1 mol草酰乙酸和2 mol NH4+，同時利用4 mol NADPH作為還原力開始合成L-賴氨酸［7］。而在細菌中除1 mol的丙酮酸在三羧酸循環(huán)中能夠產生1 mol的NADPH外，其余的NADPH均要由磷酸戊糖途徑(PPP)供給［8］。有研究表明，谷氨酸棒桿菌在以葡萄糖為碳源生成賴氨酸的過程中，大約65%的碳進入磷酸戊糖途徑(PPP)用于生產NADPH［9］。在碳代謝產量方面，戊糖磷酸途徑在經濟上更有利，因為戊糖磷酸途徑的2個循環(huán)釋放1分子 CO2，并伴隨產生2分子 NADPH，而每一個TCA循環(huán)釋放2分子CO2，并伴隨產生1分子NADPH。NADPH的主要來源是:PPP途徑的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6DP)、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6PGDH)和TCA循環(huán)中的異檸檬酸脫氫酶［10］。

增加NADPH的量可以有效地提高L-賴氨酸合成途徑中NADPH依賴性的酶的酶活力，進而提高L-賴氨酸的產量。在棒狀桿菌中，NADPH的主要供應途徑是TCA循環(huán)和戊糖磷酸途徑。為了使更多的“C”流進PPP途徑，從而提供更多的NADPH，對其基因進行基因改造是一個很好的選擇。例如，為了解除G6PD的反饋抑制作用和提高G6PD的表達，通過定點突變，使zwf基因中的243位堿基由A突變成T可以有效解除ATP、磷酸烯醇式丙酮酸和果糖-1，6-二磷酸的抑制作用，增大NADPH的量，從而有效增加L-賴氨酸的量。也可以通過基因組替代方法將zwf基因中的啟動子替換成sod中的強啟動子，增強zwf基因的表達，從而有效地增加L-賴氨酸的產量［11］。

1.2 果糖

果糖不僅僅是淀粉質原料糖化后的產物之一，也是糖蜜原料中除了蔗糖之外的另一主要組成部分，一般在10%～20%，故果糖的有效代謝對原料的利用率是非常重要的。但是Kiefer等研究發(fā)現(xiàn)，在以果糖為唯一碳源時，賴氨酸產量會比以葡萄糖為唯一碳源少30%左右，同時菌體生物量也會少20%左右［12］，認為谷氨酸棒桿菌中果糖的代謝與葡萄糖的代謝是十分不同的。當野生型谷氨酸棒狀桿菌在果糖中生長時，認為90%的果糖會通過果糖-PTS系統(tǒng)進入細胞生成果糖-1-磷酸，然后再經磷酸化生成果糖-1.6-二磷酸，而果糖-1，6-二磷酸不經過PPP途徑，很大一部分是因為6-磷酸果糖激酶主要是不可逆酶，因此，果糖-1，6-二磷酸將優(yōu)先進入糖酵解和TCA循環(huán)。約10%的進入谷氨酸棒狀桿菌的果糖被認為以果糖-6-磷酸的形式被葡萄糖PTS系統(tǒng)攝入［13］，果糖-6-磷酸在葡萄糖-6-磷酸異構酶的作用下直接進入PPP途徑，綜上所述在以果糖為碳源時，只有一小部分進入PPP 途徑生產還原力NADPH，Kiefer等人［9］利用C13標記的方法對以葡萄糖和果糖為碳源的代謝流進行了研究，發(fā)現(xiàn)在以果糖為碳源時進入PPP途徑的C代謝流僅僅為14.4%，遠遠少于以葡萄糖為碳源時進入PPP途徑的C代謝流(62.0%)，NADPH的供應量也遠遠少于以葡萄糖為碳源時的供應量，并且由此導致副產物二羥基丙酮、甘油和乳酸的增加，所以賴氨酸的產量會比以葡萄糖為唯一碳源時少很多。

基于許多研究者的經驗和自己的研究成果，Kiefer總結了對于以果糖為原料時增加賴氨酸產量的幾種方法［9］:(1)改善果糖的運輸途徑，盡量增加通過葡萄糖PTS轉運途徑的比例，通過果糖6-磷酸進入PPP途徑，增加NADPH還原力;(2)增加果糖1，6-二磷酸酶的活力，使果糖1，6-二磷酸水解為果糖-6-磷酸，然后異構為葡萄糖-6-磷酸進入PPP途徑，增加NADPH還原力;(3)敲除以果糖為碳源時的主要副產物二羥基丙酮的磷酸酶活激酶的編碼基因，減少分支代謝流。

1.3 麥芽糖

麥芽糖是由2個D-葡萄糖分子通過α構型的1，4鍵連接起來的雙糖，是淀粉液化和糖化不完全的水解產物，已經有研究表明谷氨酸棒桿菌可以有效的利用以麥芽糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長并生產氨基酸［14］，其代謝途徑一般是認為通過在4-α-葡聚糖轉移酶(由cg2523編碼)的催化下產生麥芽糊精和葡萄糖，產生的葡萄糖在葡萄糖磷酸化酶(glK)的催化下進入糖代謝，而產生的麥芽糊精在麥芽糊精磷酸化酶(malP)的催化作用下降解產生葡萄糖-1-磷酸，然后在葡萄糖磷酸變位酶的作用下生成葡萄糖-6-磷酸進入糖代謝［15］。有研究表明，glK和malP的失活會嚴重影響谷氨酸棒桿菌在麥芽糖為唯一碳源培養(yǎng)基上生長［16］。但是到目前為止，麥芽糖在谷氨酸棒桿菌中的轉運途徑并不十分明確，雖然在麥芽糖上的生長需要PTS-EI的酶活力，而PTS轉運系統(tǒng)的其他酶的失活并不影響麥芽糖的轉運。所以通過麥芽糖-H+同向轉運或者通過ATP結合轉運子轉運是很有可能的。

2 糖蜜原料的代謝

糖蜜原料以其低廉的成本和豐富的來源正受到越來越多生產廠家的關注。甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜是很好的發(fā)酵原料，而糖蜜的主要組成是蔗糖。

蔗糖的轉運吸收如圖3所示也是通過PTS系統(tǒng)轉運和磷酸化為6-磷酸-蔗糖，然后在6-磷酸-蔗糖水解酶的作用下水解為6-磷酸-葡萄糖和果糖。事實上在谷氨酸棒桿菌中的ptsS(編碼蔗糖特異性透性酶EIIABC)或者scrB(編碼6-磷酸-蔗糖水解酶)染色體的失活可以造成谷氨酸棒桿菌在以蔗糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上的不生長［17－18］。在谷氨酸棒桿菌中并沒有果糖激酶活力，但是水解的果糖磷酸化是進行以后代謝的先決條件，所以一般在谷氨酸棒桿菌中水解后產生的果糖會從細胞中分泌出，然后通過果糖-PTS攝入系統(tǒng)并磷酸化為果糖-1-磷酸進入代謝，果糖的代謝我們在前面已經進行了闡述。

圖3 谷氨酸棒桿菌中各種糖類的轉運和代謝匯總Fig.3 The overview of carbon source uptake and metabolic pathway

在以蔗糖為碳源時，一般認為只有很小百分比的碳進入PPP途徑，而其他的碳作為果糖-1，6-二磷酸進入糖酵解途徑，故以蔗糖為碳源賴氨酸的產率并不如以葡萄糖為碳源，許多研究者希望通過加強果糖進入PPP途徑代謝的方式來增加以蔗糖為碳源時賴氨酸的產量［19］。一方面，可以通過使用在編碼果糖——PTS酶的ptsF基因上具有突變的菌株，使得果糖-PTS酶衰減或阻斷果糖輸入細胞，來實現(xiàn)由谷氨酸棒狀桿菌生產的賴氨酸產量的提高，并且通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中提供葡萄糖異構酶來提高產量，葡萄糖異構酶可以外源方式添加，也可以在菌株中表達并輸出到培養(yǎng)基中。另一方面，可通過制備具有ptsF突變和在果糖輸出蛋白功能中的第二突變的谷氨酸棒狀桿菌來實現(xiàn)賴氨酸產量的提高，雙突變將輸入的果糖保留在細胞內，并且還在細胞內過量表達葡萄糖異構酶和葡萄糖激酶活性中的至少一種，以驅動輸入的果糖去往PPP途徑來提高L-賴氨酸產量。

3 新型原料的開發(fā)

3.1 纖維質原料的開發(fā)

考慮到國家對糧食用于工業(yè)生產的限制和原料成本的壓力，企業(yè)和研究者對新原料的探尋一直沒有停止過，植物木質纖維素就被認為是一個非常有前途的糧食替代者［20］，不僅價格低廉，并且具有來源豐富，品種多，可再生時間短的特點。木質纖維素包括纖維素、半纖維素和木質素，其水解液是含有葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖和纖維二糖的混合液，所以戊糖的代謝對于纖維質用于氨基酸的發(fā)酵生產十分重要。

對于核糖的代謝應該存在于大部分谷氨酸棒桿菌中，核糖通過具有核糖特異性的ATP-結合轉運子ABCrib(被rbsACBD編碼)轉運至細胞內。有研究表明，在缺失了rbsACBD的谷氨酸棒桿菌突變體SN1完全失去了利用核糖的能力，并且不能夠在以核糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長［21］。細胞內的核糖會被核糖激酶(RbsK1和RbsK2)催化生成PPP途徑的中間產物5-磷酸-核糖，然后進入代謝。

除了谷氨酸棒桿菌ATCC31831，一般的賴氨酸產生菌不能夠直接利用阿拉伯糖為碳源，有研究把大腸桿菌中分別負責編碼阿拉伯糖異構酶、核酮糖激酶，5-磷酸-核酮糖異構酶的基因片段 araA，araB，araD，在谷氨酸棒桿菌中異源表達構建成基因工程菌，使阿拉伯糖異構并磷酸化為5-磷酸-木酮糖，然后進入PPP途徑。但是在谷氨酸棒桿菌ATCC31831存在著編碼阿拉伯糖代謝的基因簇(araE，araA，araB，araD)，能夠在以阿拉伯糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長，而且它的生長速率是在同濃度葡萄糖培養(yǎng)基中的 2 倍［22－23］。

目前，大多的谷氨酸棒桿菌都不能直接以木糖為碳源，有報道稱一個尚未定義的轉運體(IMxyl)參與C.glutamicum R 對木糖的攝?。?4－25］。有研究［26］把大腸桿菌中負責編碼木糖異構酶的基因片段xylA和木酮糖激酶基因xylB在C.glutamicum R中異源表達構建成基因工程菌，能夠直接利用木糖為碳源，木糖在C.glutamicum R中通過IMxyl轉運體系進入細胞，然后直接被木糖異構酶(XI)異構為木酮糖，生成的木酮糖被木酮糖激酶(XK)磷酸化生成木酮糖-5-磷酸，進入PPP途徑。

Gopinath等人［27］就通過構建基因工程菌把代謝戊糖的基因在谷氨酸棒桿菌中表達，構建的基因工程菌能夠直接利用阿拉伯糖和木糖，并且能夠利用大米秸稈和小麥麥麩水解液作為底物，生產賴氨酸，產量有42 mmol/L。

以纖維素為碳源發(fā)酵產賴氨酸還處于理論研究階段，其賴氨酸產量也不能和糖質原料相比?；蚬こ叹泊嬖诘孜锢寐实?，酶活力不高等一些問題。如何提高酶與底物的親和力以及提高酶活性從而增強產賴氨酸的代謝途徑，是接下來要解決的問題。

3.2 工業(yè)副產物原料的開發(fā)

有許多研究者試圖尋找其他的原料或者工業(yè)生產副產物來生產賴氨酸，Rittmann等［28］研究證明，通過基因工程技術構建的谷氨酸棒桿菌可以利用甘油產生賴氨酸，甘油是生物柴油生產中的主要副產物，而賴氨酸生產菌不能直接利用甘油，通過基因工程技術把大腸桿菌中控制表達甘油激酶和3-磷酸甘油脫氫酶的基因 glpD、glpK、glpF在谷氨酸棒桿菌中表達，使其能夠在以甘油為唯一碳源的環(huán)境中生長并且產生賴氨酸。

乳清是乳產品行業(yè)的主要廢棄物，其中含有5%以上的乳糖，而谷氨酸棒桿菌并沒有能夠分解乳糖的一系列酶，所以谷氨酸棒桿菌并不能分解利用乳糖。通過基因工程技術把在乳酸鏈球菌中控制表達的分解乳糖的一系列酶的基因(醛糖-1-差向異構酶，半乳糖激酶，UDP-葡萄糖-磷酸酯尿苷基轉移酶，UDP-半乳糖-差向異構酶)在谷氨酸棒桿菌中表達［29］，除此之外，還有控制乳糖透性酶表達的基因。雖然到目前用這種方法構建的基因工程菌的發(fā)酵效率和賴氨酸產率都比較低，但是隨著分子技術的發(fā)展相信在不久的將來會越來越好。

4 現(xiàn)有原料新技術的開發(fā)

除了對非糧原料的探尋之外，節(jié)能減排也是國家鼓勵和倡導的。對于淀粉質原料來說，氨基酸產生菌一般不能直接利用淀粉，所以淀粉需要經過一系列的分解反應變?yōu)榭砂l(fā)酵型糖，這個過程中需要經過高溫蒸煮液化和長時間的糖化工序，整個過程需要大量的熱量，并且需要多次調節(jié)pH以便于酶的作用，所以有許多學者對于谷氨酸棒桿菌直接利用淀粉生產賴氨酸進行了研究，但是谷氨酸棒桿菌不能直接利用淀粉作為碳源，這就需要把分解淀粉需要的酶系在谷氨酸棒桿菌中異源表達，使其分解為谷氨酸棒桿菌可以利用的糖。

Seibold等人［30］通過把灰色鏈霉菌中的負責表達α-淀粉酶調控基因amy在谷氨酸棒桿菌DM1730中表達，能夠產生足夠高活力的淀粉酶，并且在淀粉培養(yǎng)基中能夠生長。Tateno等人也［31－32］通過把鏈球菌中α-淀粉酶調控基因通過同源重組方法轉移到氨基酸生產菌的染色體上的方法，使其表達產生胞外α-淀粉酶，并且能夠在以淀粉為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長，賴氨酸產量也達到了0.19 g/g淀粉。但是構建基因工程菌直接利用淀粉還存在著在培養(yǎng)基中超過35%的淀粉碳源沒有被利用掉的問題［30］，造成了原料利用率低和賴氨酸產率低。

工業(yè)界也在探討是否可以直接利用全玉米去胚之后液化、制糖，然后直接進行賴氨酸發(fā)酵的可能，這樣可以減去淀粉乳制備的繁雜過程，減少能源的消耗。隨著新型酶制劑的應用，應該有可能在同一pH下液化制糖和發(fā)酵，省去調節(jié)pH的原料的消耗，這樣既能簡化生產工藝，又能減少生產成本。

5 展望

碳源的費用、糖酸轉化率、提取收率和整個過程的生產效率是發(fā)酵法生產大宗氨基酸產品如味精和賴氨酸的經濟性的決定性因素，國內雖然賴氨酸價格的漲幅較大，但生產廠家的利潤并未因此增加，其主要原因是原料成本和物流費用的增加。隨著國產賴氨酸技術不斷改進，將會使產量增加，成本降低，質量改善，功能增強，酶活性提高，從而實現(xiàn)L-賴氨酸最大積累，在滿足我國對L-賴氨酸的不斷需求的同時進一步開拓國際市場。

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