羅靚芷，武俊瑞，劉佳藝，李欣，岳喜慶

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)，110866)

臭鱖魚(yú)由鱖魚(yú)腌制而成，氣味特別，且保留了鱖魚(yú)的本味原汁，肉質(zhì)醇厚，是我國(guó)獨(dú)具風(fēng)味的傳統(tǒng)水產(chǎn)制品。因?yàn)樗a(chǎn)制品生產(chǎn)的集中、季節(jié)性及原料的易腐性，采用腌制這種傳統(tǒng)加工方法，不僅保存了水產(chǎn)品豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而且產(chǎn)生了獨(dú)特的口感和風(fēng)味。將腌制水產(chǎn)制品中的優(yōu)勢(shì)微生物分離篩選出來(lái)，應(yīng)用于腌制水產(chǎn)制品的加工中，可縮短腌制水產(chǎn)制品的生產(chǎn)周期，提高產(chǎn)品質(zhì)量與品質(zhì)，因此，對(duì)腌制水產(chǎn)制品中優(yōu)勢(shì)微生物的研究非常有必要。

乳酸菌能賦予腌制水產(chǎn)制品柔和的酸味和香氣，改善產(chǎn)品風(fēng)味［1］，促進(jìn)發(fā)酵的成熟［2］，提高制品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能性。從傳統(tǒng)水產(chǎn)制品中篩選優(yōu)勢(shì)乳酸菌的研究國(guó)內(nèi)外已有很多，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者自傳統(tǒng)發(fā)酵魚(yú)制品［3］、北海淡口腌制金絲魚(yú)［4］、醉魚(yú)［5］、湘西傳統(tǒng)酸魚(yú)［6］、fish-nukazuke［7］、som-fak［8］，pleasom［9］和 Plasom［10］等中分離出乳酸菌，符合水產(chǎn)品發(fā)酵的生產(chǎn)要求。

本實(shí)驗(yàn)以具傳統(tǒng)特色的臭鱖魚(yú)為原料，依據(jù)肉制品發(fā)酵劑的篩選標(biāo)準(zhǔn)［11］，從中分離篩選鑒定優(yōu)良的乳酸菌菌株以及16S rDNA序列分析等實(shí)驗(yàn)與研究，以期得到適合生產(chǎn)發(fā)酵魚(yú)肉制品的優(yōu)良菌株，為開(kāi)發(fā)新型臭鱖魚(yú)制品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

臭鱖魚(yú)，購(gòu)于安徽黃山市與沈陽(yáng)市徽菜館。

1.2 主要培養(yǎng)基與試劑

MRS 培養(yǎng)基［12－13］;篩選培養(yǎng)基［14］;糖發(fā)酵細(xì)菌生化鑒定管，杭州天和微生物試劑有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)，天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 儀器設(shè)備

電熱手提式高壓殺菌鍋，上海醫(yī)用核子儀器廠;XS-212生物顯微鏡，南京江南永新光學(xué)有限公司;CR-21G冷凍離心機(jī)，日本HITACHI日立;PHS-25型pH計(jì)，上海雷磁儀器廠;SP-2100UV型紫外分光光度計(jì)，尤尼柯上海儀器有限公司;DNA擴(kuò)增儀，美國(guó)BIO-RAO。

2 試驗(yàn)方法

2.1 菌株的分離培養(yǎng)

無(wú)菌操作，依據(jù)GB/T9695.19－2008，稱取臭鱖魚(yú)樣品10.0 g，用滅菌剪剪碎后加入裝有90 mL無(wú)菌水和一定數(shù)量玻璃珠的三角瓶中，振動(dòng)搖晃30 min，以此作為稀釋度為10－1的樣品液。用無(wú)菌水做梯度稀釋。無(wú)菌吸取1 mL適宜濃度稀釋液至培養(yǎng)皿中，倒入適量含有2%的CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基覆蓋稀釋液，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)平板，使菌液與培養(yǎng)基混合均勻，冷凝后倒置，37℃培養(yǎng)48 h。

肉眼觀察，選取分布較好的平板，挑取分離較好的有代表性的單獨(dú)菌落，經(jīng)多次劃線分離直至獲得純菌落。將純化后的疑似菌落培養(yǎng)物接種于MRS斜面培養(yǎng)基上，37℃分別培養(yǎng)24 h后，置于4℃冰箱內(nèi)保藏待用。

2.2 菌株的形態(tài)學(xué)觀察

觀察平板上疑似菌落的形態(tài)、大小、色澤等。

挑取疑似菌落培養(yǎng)物涂片，進(jìn)行革蘭氏染色試驗(yàn)和過(guò)氧化氫酶檢驗(yàn)，于×100倍油鏡下觀察細(xì)菌的染色結(jié)果和疑似菌株的形態(tài)。

2.3 優(yōu)勢(shì)乳酸菌的篩選與生理生化特征的鑒定

根據(jù)肉制品發(fā)酵劑的篩選標(biāo)準(zhǔn)［11］進(jìn)行產(chǎn)黏性試驗(yàn)、耐鹽性試驗(yàn)、耐亞硝酸鹽試驗(yàn)、耐酸性試驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)、產(chǎn)H2O2試驗(yàn)、產(chǎn)H2S試驗(yàn)、石蕊牛奶酸凝試驗(yàn)、產(chǎn)氨試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、M.R試驗(yàn)、V.P試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、耐高低溫試驗(yàn)(15℃、45℃)、運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)、糖醇發(fā)酵試驗(yàn)。

2.4 菌株的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸能力試驗(yàn)

將鑒定出的菌株分別接種于MRS液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h。每4 h測(cè)1次。用可見(jiàn)光分光光度計(jì)于640 nm下，測(cè)定菌液的吸光度值。pH值用pH計(jì)測(cè)定。

2.5 菌株的耐溫性試驗(yàn)

不同菌株接種于其液體培養(yǎng)基中，分別置于15，20，25，30，35，40，45 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h，以不接種的液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，在640 nm條件下測(cè)底OD值。

2.6 16S rDNA序列分析

2.6.1 菌株DNA的提取

將篩選出菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，采用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的基因組DNA，并采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2.6.2 16S rDNA基因序列PCR擴(kuò)增及序列分析

16S rDNA擴(kuò)增引物:應(yīng)用細(xì)菌通用引物，正向引物 27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’;反向引物1942R:5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(50 μL):正向引物27F和反向引物 1942R 各 1.5 μL，dNTP(10 mmol/L)1.0 μL，10 × Buffer(2.5 mmol/L Mg2+)5.0 μL，ddH2O 39.0 μL，基因組 DNA 1.0 μL，Taq 聚合酶(5 u/μL)1.0 μL。

PCR陰性對(duì)照基因組DNA采用超純無(wú)菌水代替。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5 min，95℃變性 30 s，52℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min 30 s，經(jīng)45次循環(huán)，72 ℃終延伸 7 min［15－18］。

PCR產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送交北京擎科新業(yè)生物公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)得的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)已知序列進(jìn)行比對(duì)及同源性分析，應(yīng)用MEGA5.0軟件的鄰位相連(Neighbor-joining)法分析所測(cè)序列與GenBank中模式菌株16S rDNA序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌株形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

采用MRS固體培養(yǎng)基，從臭鱖魚(yú)中分離出50株菌株，觀察菌落溶鈣圈、革蘭氏染色及過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)結(jié)果，得到能產(chǎn)生溶鈣圈、革蘭氏染色呈陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶呈陰性的疑似乳酸菌11株，具體特征見(jiàn)表1。

表1 菌株形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果Table 1 Results of the morphological identification

根據(jù)表1的鑒定結(jié)果，所有的菌株都是呈乳白色、且菌落隆起表面光滑。分離純化得到的所有11株疑似乳酸菌有短桿狀、球狀，排列方式也不盡相同。

3.2 優(yōu)勢(shì)乳酸菌的篩選與生理生化特征的鑒定

將分離純化得到的11株進(jìn)行生理生化特征的鑒定試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。

根據(jù)表2的生理生化鑒定結(jié)果，分離所獲得菌株11株菌中，只有 L4、L12、L20、L36符合肉制品發(fā)酵菌株指標(biāo)的要求:不產(chǎn)黏液、能耐受6 g/dL NaCl;在pH 4.5和250 mg/dL NaNO2條件下正常生長(zhǎng);發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)氣;水解精氨酸不產(chǎn)氨;有良好的硝酸鹽還原能力;M.R反應(yīng)陽(yáng)性;V.P反應(yīng)陰性;不能發(fā)生明膠液化反應(yīng);能水解淀粉;可在15℃和45℃下生長(zhǎng)。

將篩選得到的4株菌株進(jìn)行糖醇發(fā)酵試驗(yàn)，具體結(jié)果見(jiàn)表3。

根據(jù)4株菌的表型特征和生理生化特點(diǎn)，檢索《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［19］(第八版)、《常見(jiàn)細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［20］，可以初步判斷L4為屎腸球菌(Enterococcus faecium)、L12為彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)、L20為堅(jiān)強(qiáng)腸球菌(Enterococcus durans)、L36為干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)。

表2 生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Results of physiological and biochemical identification

表3 糖醇發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of glycolysis test

3.3 菌株生長(zhǎng)曲線

將篩選得到的4株優(yōu)良乳酸菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分析生長(zhǎng)情況，見(jiàn)圖1。

圖1 乳酸菌生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of four lactic acid bacteria isolates

如圖1所示，L4在4～8 h生長(zhǎng)速度明顯高于其他菌株［21］，在8～12 h時(shí)左右達(dá)到菌體密度最大值，之后進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，Herranz等人發(fā)現(xiàn)1株腸球菌在12 h時(shí)達(dá)到菌株密度最大值［22］，與之相符。其他菌株在培養(yǎng)到8～16 h生長(zhǎng)速度明顯加快，培養(yǎng)到16 h后進(jìn)入到穩(wěn)定生長(zhǎng)期。從圖1可以看出，篩選得出的4株菌均具備較強(qiáng)的生長(zhǎng)能力。

3.4 菌株的產(chǎn)酸能力試驗(yàn)

將篩選出的4株乳酸菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分析其產(chǎn)酸能力，見(jiàn)圖2。

圖2 24 h內(nèi)乳酸菌產(chǎn)酸能力Fig.2 Acid-producing capacities of four lactic bacteria isolates

如圖2所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，4株菌株培養(yǎng)液的pH值均呈下降趨勢(shì)，培養(yǎng)初期pH值隨時(shí)間的變化不斷下降，培養(yǎng)16 h后，菌株培養(yǎng)液的pH值下降緩慢，與菌株的生長(zhǎng)曲線大體一致。培養(yǎng)至24 h時(shí)，菌株培養(yǎng)液pH值可達(dá)到4.40以下。結(jié)合生長(zhǎng)曲線與產(chǎn)酸能力，在臭鱖魚(yú)加工過(guò)程中，發(fā)酵初期腸球菌能迅速繁殖，產(chǎn)生乳酸，快速降低環(huán)境體系中pH值，為發(fā)酵與其他乳酸菌生長(zhǎng)創(chuàng)造良好的條件。

3.5 菌株耐溫性試驗(yàn)

將乳酸菌菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，在不同溫度下培養(yǎng)，分析其耐溫性，見(jiàn)圖3。

圖3 乳酸菌在不同溫度下的生長(zhǎng)情況Fig.3 Growing states of four lactic acid bacteria isolates at different temperatures

如圖3所示，4株菌在15～45℃下都能生長(zhǎng)，在25～40℃下生長(zhǎng)情況基本良好;45℃時(shí)腸球菌的生長(zhǎng)情況相對(duì)于乳桿菌好。說(shuō)明4株菌在25～40℃適宜生長(zhǎng)。以目前臭鱖魚(yú)的傳統(tǒng)發(fā)酵工藝，發(fā)酵溫度為25～30℃，篩選出的4株菌能在此范圍良好生長(zhǎng)。

3.6 菌株16s rDNA分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

3.6.1 菌株基因組DNA提取

利用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)提取菌株的基因組DNA，并采用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，得到的檢測(cè)電泳圖只有1個(gè)條帶，如圖4所示，可進(jìn)行16S rDNA基因序列PCR擴(kuò)增。

圖4 菌株基因組DNA檢測(cè)電泳圖Fig.4 Electrophoretograms of DNA from four lactic acid bacteria isolates

3.6.2 16S rDNA基因序列PCR擴(kuò)增

將菌株的基因組DNA進(jìn)行16S rDNA基因序列PCR擴(kuò)增，同時(shí)進(jìn)行PCR陰性對(duì)照試驗(yàn)，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如圖5所示，PCR陰性對(duì)照無(wú)條帶，各菌株P(guān)CR產(chǎn)物條帶單一，在1 500bp處有特異性條帶，滿足測(cè)序的要求。

3.6.3 16S rDNA同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的建立

圖5 菌株P(guān)CR擴(kuò)增凝膠電泳圖Fig.5 Electrophoretograms of PCR-amplification of 16S rDNA from four lactic acid bacteria isolates

利 用 BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，將所測(cè)定的4株菌株的16S rDNA序列，與GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù)中已知細(xì)菌的16S rDNA/rRNA序列進(jìn)行比較鑒定，尋找與目的基因序列同源性最高的已知分類地位的菌種。得到菌株L4的16S rDNA序列與屎腸球菌(Enterococcus faecium)的16S rDNA/rRNA序列同源性最高;菌株 L12的16S rDNA序列與彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)的16S rDNA/rRNA序列同源性最高;菌株L20的16S rDNA序列與堅(jiān)強(qiáng)腸球菌(Enterococcus durans)的16S rDNA/rRNA序列同源性最高;菌株 L36的16S rDNA序列與干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)的16S rDNA/rRNA序列同源性最高。

從GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù)中，提取已知的標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rRNA/DNA基因序列，利用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，獲得目的菌的分類地位或它的系統(tǒng)發(fā)育地位。如圖6所示，菌株L4與屎腸球菌(Enterococcus faecium)的系統(tǒng)位置最接近，菌株L20與堅(jiān)強(qiáng)腸球菌(Enterococcus durans)的系統(tǒng)位置最接近;菌株L12與彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)的系統(tǒng)位置最近;菌株L36與干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)的系統(tǒng)位置最接近。

圖6 優(yōu)良乳酸菌L4、L12、L20、L36的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree of four lactic acid bacteria isolates

根據(jù)16S rDNA同源性對(duì)比結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，菌株L4鑒定為屎腸球菌(Enterococcus faecium)，L12鑒定為彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)，L20鑒定為堅(jiān)強(qiáng)腸球菌(Enterococcus durans)，L36鑒定為干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)。

4 結(jié)論

(1)依據(jù)肉制品發(fā)酵劑的篩選標(biāo)準(zhǔn)，本文通過(guò)對(duì)臭鱖魚(yú)中菌株的耐鹽、耐酸、耐亞硝酸鹽、產(chǎn)酸能力、生產(chǎn)曲線和耐溫性等一系列指標(biāo)的研究，篩選出4株菌都符合肉制品發(fā)酵劑的標(biāo)準(zhǔn)，具有良好的生長(zhǎng)性能和NaCl耐受性。

(2)經(jīng)過(guò)生理生化鑒定與16S rDNA序列測(cè)定分析，鑒定L4為屎腸球菌，L12為彎曲乳桿菌，L20為堅(jiān)強(qiáng)腸球菌，L36為干酪乳桿菌。為進(jìn)一步探討乳酸菌在水產(chǎn)制品中的應(yīng)用提供依據(jù)。

［1］譚汝成，曾令彬，熊善柏，等.外源脂肪酶對(duì)腌臘魚(yú)品質(zhì)的影響［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33(5):68－71.

［2］閆波，劉寧.乳酸菌及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用與展望［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2004，25(4):22－25.

［3］林勝利，張琦琳，聶小華.發(fā)酵魚(yú)制品中乳酸菌的篩選鑒定及其初步應(yīng)用［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38(2):61－65.

［4］楊錫洪，吳海燕，解萬(wàn)翠，等.風(fēng)味咸魚(yú)乳酸菌和葡萄球菌的分離與鑒定［J］.食品科學(xué)，2009，30(21):192－194.

［5］唐思，劉章武.醉魚(yú)中菌種的分離篩選與鑒定研究［J］.中國(guó)釀造，2010，(12):120－123.

［6］曾雪峰，夏文水.湘西傳統(tǒng)酸魚(yú)中乳酸菌的分離及特性研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38(12):40－44.

［7］Takashi K，Yukino I，Saeko I，et al.Suppressive effect of Tetragenococcus halophilus，isolated from fish-nukazuke，on histamine accumulation in salted and fermented fish［J］.Food Chemistry，2012，130(3):569－574.

［8］Christine P M，Hans H H，Lone G.Characterization of lactic acid bacteria isolated from a Thai low-salt fermented fish product and the role of garlic as substrate for fermentation［J］.International Journal of Food Microbiology，1999，46(3):219－229.

［9］Pramuan S，Wanchai P，Malai B.Use of a starter culture of lactic acid bacteria in plaa-som，a Thai fermented fish［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2010，110(5):553－557.

［10］Noraphat H，Subaidah B，Saowakon W，et al.Isolation and screening of lactic acid bacteria from Thai traditional fermented fish(Plasom)and production of Plasom from selected strains［J］.Food Control，2011，22(3－4):401－407.

［11］張剛.乳酸細(xì)菌—基礎(chǔ)、技術(shù)和應(yīng)用［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2006:234.

［12］王友湘，陳慶森，閻亞麗.用于乳酸菌分離鑒定的幾種培養(yǎng)基的篩選及應(yīng)用［J］.食品科學(xué)，2007，28(9):374－378.

［13］凌代文，東秀珠.乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法［M］.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，1999.

［14］趙斌，何紹江.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)［M］.北京:科學(xué)出版社，2002:258.

［15］烏日娜，張和平，孟和畢力格.酸馬奶中乳桿菌 Lb.casei.Zhang和 ZL12－1的16S rDNA基因序列及聚類分析［J］.中國(guó)乳品工業(yè)，2005，3(6):4－9.

［16］張琦琳，林勝利，聶小華.傳統(tǒng)魚(yú)制品中優(yōu)良葡萄球菌的篩選與鑒定［J］.食品工業(yè)科技，2012，(13):178－180.

［17］藍(lán)蔚青，謝晶.傳統(tǒng)生理生化鑒定技術(shù)結(jié)合PCR法分析復(fù)合保鮮劑對(duì)冷藏帶魚(yú)貯藏期間菌相變化的影響［J］.食品工業(yè)科技，2012，(10):330－335.

［18］高陽(yáng)，王俊鋼，顧燕玲，等.新疆額爾齊斯河流域冷水魚(yú)腸道耐低溫乳酸菌的分離篩選及其遺傳差異［J］.微生物學(xué)報(bào)，2013，53(1):82－91.

［19］布坎南，吉本斯，等.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)［M］.北京:科學(xué)出版社，1984.

［20］東秀珠，蔡妙英，等.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)［M］.北京:科學(xué)出版社，2001.

［21］楊愛(ài)華，王成忠，范素琴.發(fā)酵香腸乳酸菌生理生化特性的研究［J］.中國(guó)釀造，2009(8):79－82.

［22］Herranz C，Casaus P，Mukhopandhyay S，et al.Enterococcus faecium P21:a strain occurring naturally in dryfermented sausages producing the class II bacteriocins enterocin A and enterocin B［J］.Food Microbiology，2001，18(2):115－131.

［23］謝靜，熊善柏，曾令彬，等.臘魚(yú)加工中的乳酸菌及其特性［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35(6):32－36.