于倩，曾新安

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州，510641)

銅是動物和人體必需的微量元素之一，在機(jī)體的組成和代謝中起著很重要的作用［1］。一方面，它是肌體中很多金屬酶的組成成分，另一方面也是一些蛋白的輔基，對某些蛋白質(zhì)的合成有促進(jìn)作用［2］。與無機(jī)銅鹽相比，氨基酸銅作為第三代銅補(bǔ)充劑具有獨(dú)特的優(yōu)勢，可以緩解礦物之間的拮抗作用，而且穩(wěn)定性好，生物學(xué)效價高［3］，易吸收，因此近年來受到了廣泛的關(guān)注。目前氨基酸和銅的螯合反應(yīng)主要采用液相反應(yīng)，存在反應(yīng)時間長，效率低的缺點(diǎn)［4］。因此，尋找一種更為高效的合成方法有重要意義。

脈沖電場(pulsed electric fields，PEF)是一種新興的非熱殺菌手段，在保證良好的殺菌效果的同時，對食品的色澤、口感以及營養(yǎng)物質(zhì)保存較好，成為近年來食品生物領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［5－8］，脈沖電場對美拉德反應(yīng)有一定的促進(jìn)作用［9－11］，脈沖電場可顯著促進(jìn)酯化反應(yīng)，降低其活化能［12－13］。但是，關(guān)于PEF處理對螯合反應(yīng)的影響還未見報(bào)道。本文以甘氨酸和硫酸銅為研究對象，研究PEF對該螯合反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

主要材料:甘氨酸(分析純，博奧生物有限公司，上海)、CuSO4·5H2O(分析純，啟輪化學(xué)科技有限公司，天津)、甘氨酸銅(分析純，恒綠源科技有限公司，湖北)、強(qiáng)酸性苯乙烯陽離子交換樹脂(ZG107，爭光樹脂有限公司，杭州)。

1.2 儀器與設(shè)備

脈沖電場設(shè)備為自主開發(fā)(專利號:02152160)，由高壓脈沖發(fā)生器，蠕動泵，處理室和示波器4個部分組成，產(chǎn)生的波為方形波，脈寬為40 μs，頻率1 kHz，場強(qiáng)為0～50 kV/cm。其他儀器包括恒溫水浴鍋(HH-501型，普天儀器制造有限公司，常州);pH計(jì)(PF20型，梅特勒托利多公司，瑞士);紫外-可見分光光度計(jì)(UV-1800型，島津公司，日本);傅里葉變換紅外光譜儀(Vector 33型，Bruker公司，德國)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 產(chǎn)物的鑒定

二硫腙顯色法:分別吸取硫酸銅溶液、反應(yīng)液(螯合原液)和經(jīng)過陽離子交換樹脂處理后的反應(yīng)液(主要為螯合態(tài)銅離子)，加入雙硫腙顯色劑，搖勻，靜置幾分鐘，觀察顏色的變化［14］。

紫外光譜法:將配制好的硫酸銅溶液以及螯合反應(yīng)的反應(yīng)液分別用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行掃描，觀察其紫外吸收曲線。波長掃描范圍為190～300 nm，用蒸餾水調(diào)零［15］。

1.3.2 常規(guī)加熱條件下螯合反應(yīng)最佳條件的確立

將相同濃度的硫酸銅和甘氨酸溶液混合，調(diào)節(jié)pH值后置于恒溫水浴鍋中反應(yīng)，每隔10 min取樣，冰浴。用紫外-可見分光光度計(jì)測定最大吸收波長下的吸光度，計(jì)算產(chǎn)物的生成量。分別考察氨基酸和硫酸銅體積比(螯合比)、溶液pH值、反應(yīng)溫度對單位時間內(nèi)甘氨酸銅生成量的影響，確定反應(yīng)條件［16］。

1.3.3 PEF作用下甘氨酸和硫酸銅的反應(yīng)

在1.3.2中的最優(yōu)條件下，用恒流泵使樣品以50 mL/min通過脈沖電場，處理場強(qiáng)分別10，20，30，40 kV/cm。用示波器監(jiān)測脈沖電場的波形、場強(qiáng)以及頻率。使用水浴鍋控溫，處理前后維持在50℃左右。在處理室的出口和入口處，用帶探頭的數(shù)顯溫度計(jì)監(jiān)控溫度變化，整個過程溫度波動在2～3℃。每隔10 min取樣，測定氨基酸銅含量，方法同1.3.2。

1.3.3 紅外光譜掃描

采用KBr壓片法，分別將少量樣品充分研磨后加入干燥的KBr，在紅外燈的照射下使其充分混合、壓片，置于紅外光譜儀內(nèi)進(jìn)行掃描，掃描范圍400～4 000 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)物鑒定

2.1.1 二硫腙顯色結(jié)果

由于二硫腙的N原子可提供1個弧電子與金屬離子配位，生成易溶于三氯甲烷或四氯化碳的紅色絡(luò)合物［16］，可根據(jù)鰲合原液的顏色變化對螯合產(chǎn)物進(jìn)行初步的判斷。當(dāng)向硫酸銅溶液、螯合原液以及樹脂處理后的反應(yīng)液中分別加入雙硫腙試劑后，其顯色分別為大紅色、橙紅色以及粉紅色。這說明反應(yīng)后大部分銅離子是以螯合態(tài)存在，經(jīng)過陽離子交換樹脂處理后，溶液中的銅幾乎都以螯合態(tài)存在。

2.1.2 紫外掃描結(jié)果

Cu2+在紫外區(qū)有較強(qiáng)的吸收，而甘氨酸在紫外區(qū)吸收很弱。配制一定濃度的硫酸銅溶液進(jìn)行掃描，其最大吸收峰在203 nm左右。而硫酸銅和甘氨酸反應(yīng)液的最大吸收峰在228 nm左右，與Cu2+相比有25 nm的紅移，說明溶液中的Cu2+和甘氨酸形成了穩(wěn)定的配合物。杜俊等用Cu2+和各種氨基酸反應(yīng)，用紫外掃描法也觀察到18～24 nm的紅移［17］。硫酸銅和甘氨酸銅的紫外掃描曲線見圖1。

圖1 硫酸銅和甘氨酸銅的紫外掃描曲線Fig.1 Ultraviolet scanning curve of copper sulfate and biscopper

2.2 螯合比對螯合反應(yīng)的影響

金屬離子可以和多個氨基酸形成不同的配合物，按照一定的摩爾比結(jié)合［18］。螯合比的大小直接影響螯合產(chǎn)物的穩(wěn)定性，也影響產(chǎn)物的生成量。由圖2可知，在相同時間內(nèi)，隨著氨基酸和硫酸銅螯合比的增大，生成的產(chǎn)物量逐漸增大。當(dāng)螯合比超過2∶1時，產(chǎn)量大幅度降低。當(dāng)螯合為0.5∶1和3∶1時，產(chǎn)物的最大吸收峰在210 nm左右，與甘氨酸銅標(biāo)準(zhǔn)品相差甚遠(yuǎn)。通常認(rèn)為，氨基酸與金屬離子配位數(shù)1∶1時形成的具有電荷的絡(luò)合物，易被膠體吸附固定［18］，而當(dāng)形成2∶1的內(nèi)絡(luò)鹽時，電荷趨于中性，螯合環(huán)較為穩(wěn)定，且易被植物吸收利用。因此，選擇2∶1為最佳螯合比。

圖2 不同螯合比下甘氨酸銅的生成量Fig.2 Biscopper content under different Chelation rate

2.3 pH值對螯合反應(yīng)的影響

螯合反應(yīng)受pH值影響很大，pH值太低，溶液中過多的氫離子會與銅離子競爭，影響螯合反應(yīng)的進(jìn)行;pH值太高，銅離子會轉(zhuǎn)化成氫氧化銅，阻礙反應(yīng)的進(jìn)行。由圖3可以看出，隨著pH值的增大，單位時間內(nèi)甘氨酸銅的產(chǎn)量有所提高。當(dāng)pH值達(dá)到8的時候，吸光值有所增大，但是溶液已經(jīng)呈堿性，有文獻(xiàn)表明，堿性條件下銅離子和氨基酸會發(fā)生Biuret反應(yīng)，生成另一種螯合物［19］。為了防止發(fā)生Biuret反應(yīng)生成不需要的產(chǎn)物，選擇pH值為7進(jìn)行研究。

圖3 不同pH下甘氨酸銅的生成量Fig.3 Biscopper content under different pH value

2.4 溫度對螯合反應(yīng)的影響

溫度是影響反應(yīng)速率的重要因素，增大溫度可以增加反應(yīng)物分子間的碰撞速率，從而提高反應(yīng)速度。紫外掃描光譜顯示，溫度對產(chǎn)物最大吸收波長的位置影響不大，均在228 nm左右。從圖4可以看出，隨著反應(yīng)溫度的增大，單位時間內(nèi)生成的甘氨酸銅持續(xù)增多，當(dāng)溫度從50℃升高到60℃時，甘氨酸銅生成量變化減緩。因此，從節(jié)能的角度考慮，選擇50℃進(jìn)行研究。

圖4 不同反應(yīng)溫度下甘氨酸銅的生成量Fig.4 Biscopper content under different temperature

2.5 PEF處理對螯合反應(yīng)的影響

在螯合比為2∶1，pH為7.0，溫度為50℃的反應(yīng)條件下，用不同場強(qiáng)的脈沖電場處理反應(yīng)液，對產(chǎn)物進(jìn)行紫外光譜掃描，其最大吸收波長仍然是在228 nm左右。由圖5可以看出，20 kV/cm的場強(qiáng)處理20 min后，甘氨酸銅產(chǎn)量明顯高于未經(jīng)電場處理的樣品。隨著電場強(qiáng)度的增大，促進(jìn)效果增強(qiáng)。當(dāng)場強(qiáng)達(dá)到40 kV/cm，處理時間為50 min時，甘氨酸銅的濃度提高了89%。在整個PEF處理過程中，溫度始終通過水浴維持在50℃左右，為了區(qū)分熱效應(yīng)和PEF作用，將甘氨酸和硫酸銅混合后分別設(shè)在50℃和55℃反應(yīng)，對比甘氨酸銅產(chǎn)量，結(jié)果顯示5℃溫升對反應(yīng)影響不大，而本實(shí)驗(yàn)中溫升不超過3℃，由此可以推斷，PEF處理的強(qiáng)化作用主要是非熱效應(yīng)。

氨基酸水溶液在光或超聲波等外界條件影響下，共價鍵會發(fā)生均裂，形成自由基等不成對電子的原子團(tuán)。這些自由基大都不穩(wěn)定，不能單獨(dú)存在，傾向于互相結(jié)合，或者與其他物質(zhì)的離子、自由基反應(yīng)形成新的更穩(wěn)定的分子［20］。甘氨酸分子一側(cè)有一個氨基，另一側(cè)有一個羧基，在pH值為7的中性條件下，沒有H+干擾，兩側(cè)的羧基和氨基在不同位置與金屬離子絡(luò)合，形成了螯合物甘氨酸銅。PEF是一種高強(qiáng)度的電場，能瞬時產(chǎn)生高強(qiáng)度電壓，有研究表明，PEF處理的油酸中產(chǎn)生了O－2·，從而促使油酸發(fā)生氧化為自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)［21］。當(dāng)其作用于氨基酸時，可能促使氨基酸產(chǎn)生自由基，從而使氨基酸分子自由基與銅離子迅速螯合，從而加快螯合反應(yīng)速率。

2.6 紅外光譜分析

圖5 不同PEF場強(qiáng)處理對甘氨酸銅產(chǎn)量的影響Fig.5 Bicopper content under different PEF intensity

對比許良忠［21］等人做的甘氨酸紅外圖譜和本研究。2種反應(yīng)產(chǎn)物的紅外圖譜(圖6)可以看出，pH值為7的條件下，甘氨酸的IR光譜和本實(shí)驗(yàn)螯合產(chǎn)物的紅外光譜具有明顯的差異，主要的吸收峰的位移及強(qiáng)度均發(fā)生了變化，說明硫酸銅和甘氨酸的確發(fā)生了配位反應(yīng)。由圖中可以看出，υ(NH3+)的吸收帶均從3 170 cm－1發(fā)生了轉(zhuǎn)移，在3 263 cm－1左右和3 335 cm－1左右出現(xiàn)了υas(NH2)、υs(NH2)吸收峰，說明甘氨酸中的氨基參與了配位反應(yīng)，形成了相應(yīng)的甘氨酸配合物［22］。

圖6 甘氨酸銅的紅外吸收圖譜Fig.6 Infrared spectrogram of biscopper

表1 不同處理?xiàng)l件下的甘氨酸銅譜帶分布Table 1 The assignmemt of the vibrational spectrum of different biscoppers

羧酸成鹽后的非對稱與對稱伸縮振動的頻率之差△υ可以用來來衡量金屬與氧M-O形成價鍵的共價程度。△υ越大，表明金屬原子和氧原子共價程度越大，M-O的配位鍵越牢固［23］。由表1的數(shù)據(jù)可以算出，經(jīng)PEF處理前后的甘氨酸銅△υ值分別為208 cm－1和216 cm－1，說明經(jīng)PEF處理后，甘氨酸銅中的銅原子與氧原子共價程度更深，配位鍵更牢，從而證明螯合產(chǎn)物的穩(wěn)定性得到了提高。

3 結(jié)論

本文研究了高壓脈沖電場對硫酸銅和甘氨酸的螯合反應(yīng)的影響。結(jié)果表明，在螯合比2∶1、反應(yīng)pH 7.0，反應(yīng)溫度50℃條件下，PEF顯著促進(jìn)了該反應(yīng)的進(jìn)行，隨著場強(qiáng)的增加，促進(jìn)效果越明顯，且生成產(chǎn)物更為穩(wěn)定。

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