林 海 周 輝 劉 煜 林 宏 西安市中醫(yī)院腦病科（西安710001）

△ 第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（西安710000）

◇西安市第五人民醫(yī)院（西安710000）

腦梗塞是最常見的缺血性腦血管病，由于血管狹窄或閉塞阻斷血流而引起局部腦組織壞死。有關(guān)缺血性腦卒中損傷的發(fā)病機(jī)理，近年研究發(fā)現(xiàn)［1］膠質(zhì)細(xì)胞在梗塞灶周圍缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元的損害中發(fā)揮重要作用，無論膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)元的損害，還是遲發(fā)性神經(jīng)元死亡都與它們之間的縫隙連接蛋白（connexin，Cx）密切相關(guān)。缺血性腦卒中屬于中醫(yī)“中風(fēng)”范疇，中醫(yī)認(rèn)為該病是由于氣血逆亂，產(chǎn)生風(fēng)、火、痰、瘀，導(dǎo)致腦脈痹阻。多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為氣虛血瘀是其主要發(fā)病機(jī)制之一，臨床上活血類中藥制劑應(yīng)用廣泛，已被證實(shí)具有良好的治療及預(yù)防作用。腦梗塞中醫(yī)治療中益氣、活血類中藥制劑聯(lián)合使用文獻(xiàn)報(bào)道較少，其具體作用機(jī)制目前仍不明確。本實(shí)驗(yàn)研究從縫隙連接蛋白Cx43、CX32在大鼠缺血后膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元中的表達(dá)情況，從分子角度揭示益氣活血理論指導(dǎo)下的中藥制劑（黃芪注射液、川芎嗪注射液）在治療或改善缺血性腦損傷中的可能機(jī)制，同時(shí)為益氣、活血中藥制劑的在臨床中聯(lián)合應(yīng)用提供一定的理論支持。

1 材料與方法1.1 試劑與器材 RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒與PCR試劑盒（Takara公司），隨機(jī)引物（北京奧科生物合成），瓊脂糖凝膠（Biowest公司），Cx32，Cx43抗體（Santa公司），二抗與DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），Trizol（Invitrogen公司）。低溫冷凍離心機(jī)（法國 Heraeus公司），PCR儀與電泳儀（Biorad公司），培清JS－680C全自動凝膠成像系統(tǒng)（上海培清科技有限公司），成像所用軟件（Sensi－Capture公司），ECL發(fā)光儀（美國UVP公司）。

1.2 模型的建立及分組 雄性Sprague－Dawley大鼠70只（由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究中心提供，許可證號：SCXK陜（2010－04）），體重200～250g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后采用王健等［2］方法制作氣虛血瘀證動物模型。實(shí)驗(yàn)第11天，按改進(jìn)的Longa線栓法制作不開顱大鼠大腦中動脈阻塞（MCAO）模型，術(shù)后用青霉素4萬單位/只，腹腔注射以抗感染。動物清醒后①不能完全伸展對側(cè)前爪者；②爬行時(shí)出現(xiàn)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈者；③行走時(shí)身體向?qū)?cè)倒者；④大鼠活動能力下降，為手術(shù)成功標(biāo)志。

70只大鼠隨機(jī)分為4組：空白對照組（n＝10），模型組，黃芪＋川芎嗪組，川芎嗪組12h、24h各10只。

1.3 標(biāo)本采集 于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，各組大鼠用0.4%戊巴比妥鈉（10mL/kg）腹腔麻醉，經(jīng)左心室至升主動脈插管，先以150mL生理鹽水快速沖洗，繼之以冷的（4℃）含40g/L多聚甲醛的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）先快后慢灌流固定2h，然后取出前腦置蔗糖（200g/L）中4℃直至組織沉底。取一份缺血腦組織經(jīng)過脫水，浸蠟，用切片機(jī)切制腦梗塞灶的連續(xù)冠狀切片（片厚5μm），切片分組收集，備行HE染色及免疫組化。取一份缺血腦組織，分置液氮保存，提取RNA及總蛋白。

1.4 免疫組織化學(xué)染色 切片經(jīng)0.01mol/L PBS漂洗3×10min后入含30mg/LTriton X－100的PBS 30min（室溫）；經(jīng)1∶3000小鼠抗Cx43血清（Sigma）或1∶3000兔抗Cx43血清（Sigma）孵育24h（室溫）；再經(jīng)生物素標(biāo)記的抗血清IgG（1∶500，Sigma）室溫下孵育2h；生物素－卵蛋白－HRP復(fù)合物（ABC，1∶500，Sigma）室溫下孵育2h；葡萄糖氧化酶－DAB－硫酸鎳銨法呈色，常規(guī)貼片、干燥、脫水透明、封片。每步驟后均用0.01mol/L KPBS（pH7.4）充分洗滌。

1.5 RT－PCR檢測 Cx43、Cx32mRNA表達(dá) 取部分腦組織，Trizol一步法提取總RNA，按試劑盒說明一步法逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)Genbank查詢目的基因序列 ，Primer 5.0設(shè)計(jì)引物 ，GAPDH 為內(nèi)參照 ，引物序列（Cx43上游引物：5’－GCGGCTTGCTGAGAACCT AC－3’and下游引物 ，5’－CAGTGG TGGCGTGGTAAG GA－3’，反應(yīng)產(chǎn)物309bp；GAPDH 上游引物：5’－GAA ACC TGC CAA GTA TGA TG －3’and 下游引物：5’－ACCAGGAAATGAGCTTTA CA－3’，反應(yīng)產(chǎn)物 191bp。Cx32上游引物：5’－CTGCTCTACCCGGGCTATGC－3’和下游引物：5’－CAGGCTGAGCATCGG TCG CTCTT－3’，擴(kuò)增片段長度389bp）。用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析 ，以內(nèi)參GAPDH mRNA條帶光密度值作為標(biāo)準(zhǔn) ，計(jì)算Cx43mRNA表達(dá)的相對量。

1.6 Western－blot分析蛋白表達(dá) 取部分缺血腦組織，加入組織裂解液，與低溫環(huán)境中采用勻漿器進(jìn)行研磨10min，冰上放置30min，然后再研磨5min。將研磨的勻漿導(dǎo)入離心管中，進(jìn)行低溫冷凍離心25min（12000rpm，4℃），棄沉淀，取部分上清與上緩沖液混合，沸水浴中煮沸8min，1000rpm離心5 min，取上清，進(jìn)行SDS－PAGE蛋白凝膠電泳，取目的條帶，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2h。加入一抗，4℃孵育過夜。經(jīng)含0.1%Tween－20的PBST溶液洗后，加入熒光鼠抗（1∶1000），室溫孵育1h。采用UVP成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描，測定目的蛋白條帶的積分密度值，以β－actin作為內(nèi)參組。計(jì)算Cx43與Cx32基因表達(dá)的相對量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 測得的數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0for Windows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)（±s）表示，組間比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果2.1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評分 各組大鼠術(shù)后神經(jīng)行為學(xué)評分顯著高于空白對照組（P＜0.01）；模型組于12h時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)行為學(xué)評分達(dá)到高峰，24h時(shí)間后逐漸下降；黃芪注射液＋川芎嗪注射液組各時(shí)間點(diǎn)較模型組相比神經(jīng)功能缺損評分均減少（P＜0.05）。見表1。

表1 各組神經(jīng)行為學(xué)評分（±s）

表1 各組神經(jīng)行為學(xué)評分（±s）

注：與模型組比較，△P＜0.05

10 0 0 0模型組 10 2.78±0.52 2.53±0.55 2.22±0.61黃芪＋川芎嗪組 10 2.69±0.48 1.71±0.62△ 1.59±0.55△川芎嗪組 10 2.81±0.50 1.98±0.59△C 12h 24h空白對照組組 別 n 1.61±0.51

2.2 免疫組化

2.3 Western Blot檢測Cx43、Cx32蛋白變化

2.4 RT－PCR檢測Cx43、Cx32mRNA表達(dá)

A、B、C、D、E、F、G分別表示空白對照，模型組，黃芪注射液＋川芎嗪注射液12h、24h，川芎嗪注射液12h、24h組Cx43的表達(dá)情況

A、B、C、D、E、F、G分別表示空白對照，模型組，黃芪注射液＋川芎嗪注射液12h、24h，川芎嗪注射液12h、24h組Cx32的表達(dá)情況

表2 Western Blot檢測膠質(zhì)細(xì)胞Cx43、神經(jīng)元Cx32蛋白表達(dá)（±s，n＝10）

表2 Western Blot檢測膠質(zhì)細(xì)胞Cx43、神經(jīng)元Cx32蛋白表達(dá)（±s，n＝10）

注：▲P＜0.01VS空白對照組；△P＜0.05VS相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)模型組

Cx43 Cx32組 別12h 24h空白對照組 18.24±3.09 19.89±3.32 12h 24h模型組 31.59±2.99▲ 23.07±2.80▲ 30.57±3.38▲ 24.19±3.11▲黃芪＋川芎嗪組 22.58±3.12△ 15.21±2.75△ 21.01±2.87△ 16.55±2.86△川芎嗪組 24.66±2.83△ 18.54±2.61 22.98±2.57△19.07±2.91

如表2所示、結(jié)合圖1可以看出，相對于空白對照組，模型組Cx43與Cx32的表達(dá)量明顯升高（P＜0.01）。黃芪＋川芎嗪組較模型組12h、24h能夠明顯下調(diào)Cx43與Cx32的表達(dá)（P＜0.05）。川芎嗪組較模型組12hCx43、Cx32下調(diào)明顯（P＜0.05），24h不明顯（P＞0.05）。

表3 RT－PCR檢測膠質(zhì)細(xì)胞Cx43mRNA、神經(jīng)元Cx32mRNA表達(dá)（±s）

表3 RT－PCR檢測膠質(zhì)細(xì)胞Cx43mRNA、神經(jīng)元Cx32mRNA表達(dá)（±s）

注：▲P＜0.01VS空白正常組；△P＜0.01VS相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)模型組

Cx43 Cx32組 別12h 24h空白對照組 13.11±2.24 17.59±2.47 12h 24h 23.79±2.11模型組 31.66±1.87▲ 19.84±2.31 40.57±2.27▲ 30.65±2.33黃芪＋川芎嗪組 15.98±2.09△ 13.01±1.75△ 22.55±2.66△ 17.89±2.39△川芎嗪組 17.60±2.24△ 17.29±1.98 26.51±2.49△

圖1 局灶性腦缺血后膠質(zhì)細(xì)胞Cx43、神經(jīng)元Cx32western Blot結(jié)果

圖2 腦缺血后膠質(zhì)細(xì)胞Cx43mRNA RT－PCR結(jié)果

圖3 腦缺血后神經(jīng)元Cx32mRNA RT－PCR結(jié)果

如表3、圖2、圖3所示可以看出：相較于正常組，模型組Cx43、Cx32mRNA含量明顯增加（P＜0.01）。黃芪＋川芎嗪組與模型組12h、24h相比Cx43mRNA、Cx32mRNA含量明顯減少（P＜0.05）。與模型組比較川芎嗪組12hCx43mRNA、Cx32mRNA下調(diào)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），24h則不明顯（P＞0.05）。

3 討 論中醫(yī)研究中，大多數(shù)學(xué)者傾向于認(rèn)為氣虛血瘀是缺血性中風(fēng)的主要病因病機(jī)。清代醫(yī)家王清任在《醫(yī)林改錯》中更明確指出：“人過半百元?dú)庖烟?，氣虛無力推動血行，使之瘀血偏滯于體，乃罹患偏癱”，“元?dú)饧忍?，必不能達(dá)于血管，血虛無氣，必停留而瘀”，其治則應(yīng)為益氣活血。根據(jù)這一理論本實(shí)驗(yàn)選用黃芪注射液及川芎嗪注射液為實(shí)驗(yàn)用藥，在模型制備中采用病證結(jié)合的大鼠模型即中醫(yī)氣虛血瘀模型和腦缺血模型相結(jié)合，力求實(shí)驗(yàn)研究更符合中醫(yī)辨證施治的思想，使研究結(jié)果更加精確客觀。通過觀察兩藥合用及單用對缺血性腦損傷病理過程的影響，揭示中醫(yī)益氣活血理論針對缺血性腦損傷的可能機(jī)理。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)腦缺血早期梗塞面積會繼發(fā)性擴(kuò)大，可能與通過縫隙連接（gap junction，GJ）的信號傳導(dǎo)有關(guān)，Lin等［3］認(rèn)為GJ有利于引起細(xì)胞死亡的凋亡信號在死亡的神經(jīng)元與存活的神經(jīng)元間擴(kuò)散，進(jìn)一步加大腦缺血損害的范圍，阻斷GJ可減輕腦缺血損傷的程度?？p隙連接是相鄰細(xì)胞膜對應(yīng)面上一對接合體構(gòu)成的縫隙連接通道，可存在于相同細(xì)胞間和不同細(xì)胞間。近幾年研究發(fā)現(xiàn)縫隙連接不僅存在于星型膠質(zhì)細(xì)胞間，而且也存在于神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞之間，使在各種刺激后神經(jīng)元與星型膠質(zhì)細(xì)胞間進(jìn)行信息交流成為可能。Cotrina等［4］的研究表明腦缺血時(shí)存活的星型膠質(zhì)細(xì)胞間的GJ通道保持開放。有研究［5］發(fā)現(xiàn)在病理損傷情況下縫隙連接參與了損害過程。Mesnil等［6］發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染胸苷激酶的細(xì)胞會死亡，而且非轉(zhuǎn)染胸苷激酶的也細(xì)胞會死亡，認(rèn)為這種旁觀者死亡現(xiàn)象與縫隙連接有關(guān)。Cx43敲除鼠碰傷后海馬CA1區(qū)損害明顯減輕。腦缺血后縫隙連接參與神經(jīng)元損傷的可能機(jī)理為梗塞灶中心和梗塞灶周邊細(xì)胞間的縫隙連接是清除缺血產(chǎn)生過多的Ca2＋、IP3等產(chǎn)物的重要途徑，過高的Ca2＋、IP3會引起星型膠質(zhì)細(xì)胞和遠(yuǎn)隔的神經(jīng)元異常興奮（spreading depression），梗塞灶周邊的細(xì)胞由于播散性抑制而處于去極化狀態(tài)，最后發(fā)生死亡［7］。

本研究結(jié)果顯示，黃芪注射液、川芎嗪注射液合用及川芎嗪注射液單用［8］，均可對缺血性腦損傷的病理過程產(chǎn)生一定影響，減輕神經(jīng)功能缺損的程度。主要表現(xiàn)在黃芪注射液聯(lián)合川芎嗪注射液、川芎嗪注射液單用可下調(diào)腦缺血后膠質(zhì)細(xì)胞Cx43，神經(jīng)元Cx32的過度表達(dá)。從藥物聯(lián)合及單用結(jié)果分析，腦缺血后12h時(shí)Cx43、Cx32表達(dá)較同時(shí)段對照組明顯增高，黃芪注射液、川芎嗪注射液合用及川芎嗪注射液單用均可下調(diào)Cx43、Cx32表達(dá)，腦缺血后24h時(shí)黃芪注射液、川芎嗪注射液合用對Cx43、Cx32的表達(dá)仍能產(chǎn)生一定的抑制作用，而川芎嗪注射液單用則對Cx43、Cx32表達(dá)無明顯影響。神經(jīng)功能評定的結(jié)果表明，腦缺血后12h神經(jīng)行為學(xué)評分較對照組顯著增高，24h后逐漸減少。兩藥合用及單用均可在一定程度上改善大鼠腦缺血后的神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)。同時(shí)觀察發(fā)現(xiàn)存在藥物合用較單用在神經(jīng)功能恢復(fù)的時(shí)間上要快。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明益氣活血類中藥制劑治療或改善缺血性腦損傷的可能機(jī)理與腦缺血后的縫隙連接蛋白表達(dá)下調(diào)有關(guān)。同時(shí)結(jié)果顯示在影響縫隙連接蛋白的下調(diào)及神經(jīng)行為學(xué)評分中益氣、活血藥物伍用優(yōu)于活血藥物單用［9］，表明益氣、活血類藥物之間具有協(xié)同、互補(bǔ)的作用。

［1］Wishcamper CA，Brooks DM，Coffin JD，et al.Focal cerebral ischemia upregulates SHP－1in reactive astrocytes in juvenile mice［J］.Brain Res，2003，974（1）：88－98.

［2］Rawanduzy A，Hansen A，HansenTW，et al.Effective reduction of in－farct volume by gap junction blockade in a rodentmodel of stroke［J］.JNeurosurg，1997，87（6）：916－920.

［3］Lin JH，Weigel H，Ctrina mL，et al.Gap－junctionmediated propagation and amplification of cell injury［J］.Nat Neurosci，1998，1（6）：494－500.

［4］Cotrina mL，Kang J，Lin JH，et al.Astrocytic gap junctions remain open during ischemic conditions［J］.J Neurosci，1998，18（7）：2520－2537.

［5］Mesnil M.，C.Piccoli G，Tiraby K.Willecke，et al.Bystander killing of cancer cells by herpes simplex virus thymidine kinase gene is mediated by connexins［M］.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996，93：1831–1835.

［6］Frantseva MV，Kokarovtseva L，Naus CG，et al.Specific gap junctions enhance the neuronal vulnerability to brain traumatic injury［J］.J Neurosci.2002，22（3）：644－653.

［7］Saito R，Graf R，Hubel K，et al.Reduction of infarct volume by halothane：effect on cerebral blood flow or perifocal spreading depression－like depolarizations［J］.J Cereb Blood Flow Metab.1997，17（8）：857－864.

［8］謝 健，楊 博，任黎萍.川芎嗪聯(lián)合缺血預(yù)處理對腦缺血－再灌注損傷保護(hù)作用的研究［J］.陜西中醫(yī)，2008，29（7）：926－927.

［9］詹海濤，吳劍峰，朱凡特.刺五加對大鼠實(shí)驗(yàn)性腦缺血－再灌注損傷的保護(hù)作用［J］.陜西醫(yī)學(xué)雜志，2009，38（4）：424－425.