高群，高少波，于莎，詹瑛，李超，劉世國

（青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院婦產科，山東 青島 266003）

妊娠期糖尿病（GDM）是指在妊娠期首次發(fā)生或出現的不同程度的糖耐量異常。盡管目前對于GDM的發(fā)病病因和機制還未完全闡明，但多數研究結果認為，GDM是遺傳和環(huán)境因素共同作用引起的臨床綜合征［1］。褪黑素（MLT）受體基因1B（MTNR1B）是最新發(fā)現的2型糖尿?。═2DM）的候選基因［2］，MTNR1B的多個基因位點是T2DM的易感基因，如研究較多的rs10830963單核苷酸多態(tài)性（SNP）與T2DM和GDM具有相關性［3］。已有研究結果顯示，MTNR1B基因5′端啟動子區(qū)中的rs4753426位點周圍可能存在某個轉錄因子的結合位點，可能與 MLT的表達水平相關［4］。通過對不同種族人群 MTNR1B－rs4753426（C／T）位點的研究顯示，C等位基因是突變基因，且與FPG水平升高密切相關［5］。本研究采用聚合酶鏈反應（PCR）和DNA測序技術判定MTNR1B－rs4753426位點基因型和等位基因頻率在GDM孕婦和正常孕婦間的差異，旨在探討rs4753426位點SNP與GDM發(fā)病的關系。現將結果報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2011年7月—2012年7月，選取我院產科門診或住院GDM孕婦93例為GDM組，年齡（30.85±9.46）歲，孕周（25.65±3.84）周，體質量指數（BMI）（22.99±4.97）kg／m2。另選取同期正常孕婦165例為對照組，年齡（28.96±8.52）歲，孕周（26.84±2.76）周，BMI（23.47±5.48）kg／m2。兩組年齡、孕周、孕產次、BMI等相比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。本研究受檢者均符合美國糖尿病協會（ADA）的診斷標準［6］。所有研究對象均為中國漢族北方人。所選孕婦均除外多胎妊娠、慢性高血壓、T1DM或T2DM、感染、腎功能異常、類風濕性關節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準，孕婦均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集和相關指標檢測 各組孕婦均于清晨空腹6～8 h后行口服75 g葡萄糖耐量試驗（OGTT），同時采集空腹靜脈血5 mL測定空腹胰島素（FIN）和空腹血糖（FPG）水平，FIN測定采用放射免疫法（美國LINCO公司試劑盒），FPG測定采用日立7600－2020生化自動分析儀；另采集每例孕婦的靜脈血3 mL，EDTA抗凝，－20℃條件下保存，用于提取DNA。記錄孕婦首次產前檢查（孕6～12周）的身高、體質量，計算孕前BMI；采用穩(wěn)態(tài)模型評估法計算胰島素抵抗指數（HOMA－IR）及胰島β細胞功能指數（HOMA－β）。

1.2.2 MTNR1B－rs4753426位點SNP檢測 用改良Miller法提取全血DNA，經檢測基因組DNA濃度（10～20 mg／L）合格，基因組DNA －20℃冰箱保存。采用PCR對目的基因進行擴增。引物序列應用Pri mer 5軟件進行設計，引物序列：上游引物5′－CTCAATACCCACCCTCAA－3′，下游引物5′－CCAACAGAAGAATGGATAAG－3′。PCR 反 應 過程：總反應體系20μL，95℃預變性5 min；然后94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸7 min。取PCR擴增產物2μL，于15 g／L瓊脂糖凝膠上電泳。將擴增產物及PCR上游引物送至上海申速生物技術有限公司進行測序，采用Sanger雙脫氧鏈終止法應用ANI PRISM 3730XL測序儀進行DNA測序。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料結果以±s表示，兩組間比較采用t檢驗；基因型及等位基因頻率以率表示，統(tǒng)計處理采用χ2檢驗；應用Har dy－Weinber g遺傳平衡定律檢驗兩組基因型群體代表性分布。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 兩組孕婦各臨床觀察指標的比較

GDM組孕婦FPG、FIN水平及 HOMA－IR高于對照組，差異均有顯著性（t＝2.518～6.074，P＜0.05）。GDM組孕婦HOMA－β低于對照組，差異有顯著性（t＝18.391，P＜0.05）。見表1。

表1 兩組孕婦各臨床觀察指標的比較（±s）

表1 兩組孕婦各臨床觀察指標的比較（±s）

組別 n 年齡（歲） 孕周（周） BMI（kg／m2） FPG（c／mmol·L－1） FIN（z／mU·L－1） HOMA－IR HOMA－β對 照 組 165 28.96±8.52 24.84±2.96 23.47±5.48 4.62±1.87 15.37±11.26 2.96±2.79 274.46±50.21 GDM組 93 30.85±9.46 25.65±3.84 22.99±4.97 6.43±2.75 19.96±15.41 5.95±4.26 130.59±65.35

2.2 兩組孕婦MTNR1B－rs4753426位點基因型與等位基因頻率比較

采用PCR擴增產物直接DNA的測序結果顯示，rs4753426位點存在CC、CT、TT等3種基因型。兩組基因型頻率分布均符合Har dy－Weinber g遺傳平衡定律（P＞0.05）。GDM組CC、CT和TT基因型頻率分別為72.04%、21.51%和6.45%，對照組CC、CT、TT基因型頻率分別為53.94%、40.00%和6.06%，兩組比較，差異有顯著性（χ2＝9.342，P＜0.05）。GDM 組 MTNR1B－rs4753426位點C、T等位基因頻率分別為82.80%、17.20%，對照組分別為73.94%、26.06%，兩組比較，差異也有顯著性（χ2＝5.285，P＜0.05）。

3 討 論

MLT是生物體內普遍存在的一種吲哚類激素，在哺乳動物和人體內主要由腦部松果腺分泌，其分泌受光照影響，表現為明顯的晝低夜高的節(jié)律變化，它調節(jié)著晝夜節(jié)律、睡眠、內分泌、免疫及抗衰老等多種重要生理功能。人類MLT的調節(jié)作用由MLT受體1（MT1）和MT2介導，兩種受體都是G－蛋白耦聯受體。MTNR1B定位于染色體11q21－122（8）上。其轉錄受體介導了MLT對胰島素分泌的抑制作用，其對胰島素分泌的抑制作用可能導致胰島素分泌的晝夜節(jié)律［7］。MTNR1B基因與FPG水平及胰島β細胞功能密切相關［8］，已成為目前研究T2DM和GDM遺傳發(fā)病機制的熱點之一。研究結果顯示，MTNR1B基因主要在視網膜和腦組織中表達，同時該基因轉錄產物在胰島β細胞中表達，通過MLT信號轉導途徑，介導對胰島素分泌的調節(jié)，在T2DM的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［9］。隨著人類全基因組SNPs研究的不斷深入，迄今為止已發(fā)現了MTNR1B基因的多個位點，如rs10830963、rs－1387153、rs4753426等位點的SNP與T2DM發(fā)病風險相關，其中研究較多的是rs1083963位點，多項研究顯示，該位點的CG和GG基因型與FBG水平和T2DM患病風險顯著相關［10］。國內研究也證實rs1083963位點G等位基因與T2DM和GDM發(fā)病風險的相關性［11］，但尚未見rs4753－426位點 SNP與T2DM或GDM的相關性研究。

研究證實，MTNR1B基因rs4753426位點位于MTNR1B基因上游調節(jié)區(qū)內。QIU等［12］利用TF Search基因軟件對rs4753426 DNA序列進行潛在轉錄因子的研究，發(fā)現了位于其附近的轉錄因子（v－Myb）的結合位點，并進一步證實rs4753426位點的不同等位基因的改變，可導致MTNR1B的表達水平的差異。通過研究德國索布地區(qū)人群MTNR1B－rs4753426（C／T）位點顯示，C等位基因是突變基因，rs4753426位點CC和CT基因型均與T2DM的發(fā)病風險密切相關［13］。

本研究結果證實，GDM孕婦存在FPG水平升高、高胰島素血癥和嚴重的IR，與其他研究結果一致［14］。傳統(tǒng)理論認為，由于妊娠期各種妊娠激素和細胞因子的影響，胰島素分泌處在可代償或更高水平，以維持正常血糖的穩(wěn)態(tài)，目前導致GDM病人胰島素抵抗的機制仍不十分清楚，但遺傳易感因素與環(huán)境的共同作用不容忽視。

本研究通過對93例GDM孕婦和165例正常孕婦進行對照研究，結果顯示，兩組孕婦基因型頻率比較，差異具有顯著性。提示MTNR1B rs4753426位點與GDM的發(fā)生具有相關性。GDM組的C等位基因頻率明顯高于對照組，差異也有顯著性，提示rs4753426位點的C等位基因頻率在GDM組孕婦中明顯升高，攜帶C等位基因孕婦GDM發(fā)病風險可能較高。

總之，本文的研究結果顯示，rs4753426位點與GDM存在相關性，可能是GDM的易感基因位點，與其他易感位點是否具有協同作用導致GDM有待進一步研究。雖然研究已顯示MTNR1B基因是與T2DM關聯性很強的基因之一，但該基因似乎有多個SNPs位點與T2DM遺傳易感性相關［15］，因此進一步研究MTNR1B基因SNP在GDM發(fā)病中的作用具有重要意義。

表2 兩組孕婦MTNR1B－rs4753426基因型頻率與等位基因頻率比較（例（χ／%））

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