李海燕 黃旭琳 黃梓楊 陳少蓮 張詠莉

近幾年來對GNB3基因多態(tài)性與高膽固醇血癥、冠心病、高血脂等關(guān)系的研究已成為國內(nèi)外關(guān)注熱點。研究GNB3基因多態(tài)性與心血管疾病遺傳易感性將有助于了解GNB3基因在不同人群中分布情況，探索疾病的發(fā)病機制。有研究顯示，GNB3 A(-350)G多態(tài)性可影響到G2蛋白活性。近年報道GNB3的基因A(-350)G多態(tài)性與EH的關(guān)系，結(jié)果不一致。對德國[1]、澳大利亞人的一些研究報道A(-350)G多態(tài)性與EH 有關(guān)聯(lián)[2]，而來自日本[3]、法國、美國等的一些研究報道則無關(guān)聯(lián)。到目前為止還未見到關(guān)于廣東地區(qū)GNB3基因多態(tài)性與心血管疾病遺傳易感性的研究報道，研究廣東地區(qū)GNB3基因多態(tài)性與心血管疾病遺傳易感性并與其他國家和地區(qū)人群對比，可以找到廣東地區(qū)人群中與心血管疾病遺傳易感性相關(guān)的GNB3基因型，對廣東地區(qū)心血管疾病做出盡早的預(yù)防、診斷和治療。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2010年在廣東藥學(xué)院第一附屬醫(yī)院采集原發(fā)性高血壓患者血樣50份，均符合世界衛(wèi)生組織高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)，相互之間無血緣關(guān)系。

1.2 基因組DNA制備

1.2.1 采用傳統(tǒng)的酚-氯仿抽提法。

1.2.2 利用RNA/DNACalculator對所提DNA的質(zhì)量和濃度進行測量。

1.3 GNB3 A(-350)G位點PCR反應(yīng)

1.3.1 引物序列

上游5ˊ-AGA GGA TGG TGG GGT TGG GAG G-3ˊ

下游5ˊ-GAG GCT GTG AAA GCA GGG GTC AG-3ˊ

1.3.2 PCR反應(yīng)體系

反應(yīng)體系為 50 μl:4 μL DNA 溶液，2.5 U Taq 酶，引物工作液濃度每條為0.4 μM，dNTPs每種終濃度0.2 μM，標(biāo)準(zhǔn)的PCR buffer。

1.3.3 PCR反應(yīng)條件

預(yù)變性 95℃ 5 min，后94℃ 60 s，60℃ 45 s，72℃ 60 s，共35 個循環(huán)，72℃ 7 min，4℃保存。

1.3.4 瓊脂糖電泳:

PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳(離子強度0.5×TBE)，100V恒壓電泳30 min及凝膠自動成像分析系統(tǒng)檢測結(jié)果。A(-350)G擴增片段長度361bp，約61bp處為本研究觀察G→A突變點。

1.4 測序反應(yīng)

1.4.1 PAG凝膠配制和灌膠 配制含7 mmol/l尿素的6%變性聚丙烯酰胺凝膠;將洗凈晾干的凝膠板裝上膠架，放置夾緊。量取50 mlPAG膠液，加入10%過硫酸胺260 μl，TEMED 25 μl，混勻后緩慢灌入膠板中，靜止凝固大約3 h。

1.4.2 樣品處理 取12 μl去離子甲酰胺和0.5 μl PE GeneScan400 hD分子量內(nèi)標(biāo)，按上述比例混合成Loading Buffer;取7 μl Loading Buffer加入1 μl PCR 擴增產(chǎn)物(1/8 稀釋)，混勻離心，然后于PCR儀上95℃變性4 min，后馬上置于冰上，直至上樣。

1.4.3 測序凝膠電泳 打開計算機和DNA自動測序儀主機，放置凝膠板。若玻板檢測合格，倒入電泳液進行預(yù)電泳。停止后點樣。用ABI PrismTM 310 Collection軟件收集數(shù)據(jù)。電泳條件為1000V，30W，電泳2 h。

2 結(jié)果

2.1 人類基因組DNA提取 共提取正常人群和原發(fā)性高血壓患群人類基因組樣品100份。

2.2 GNB3 A(-350)G位點的PCR反應(yīng) 各樣品PCR反應(yīng)瓊脂糖電泳圖如下。

2.3 GNB3 A(-350)G位點PCR產(chǎn)物測序反應(yīng)

2.3.1 廣東地區(qū)正常人群GNB3 A(-350)G位點測序結(jié)果正常人50份樣品無一例突變，基因型均為GG，基因型頻率100%。如N-10樣品GNB3 A(-350)G堿基序列:

GCACTGACCCTCTCTCCGTCTGTGCATAAGGTCGTGAA

GATCT CTCAG CCAGG GGCCA GTCGA GTGTA TCACA GATTC TGTGA

2.3.2 廣東地區(qū)原發(fā)性高血壓患群GNB3 A(-350)G位點測序結(jié)果 患者45份樣品，有2例D-10和D-50發(fā)生了G→A突變，基因型為GA，基因型頻率4.4%。如D-10樣品G→A突變堿基序列:

CAATGGCTCTCTCTCAGTCTGTGCATAAGGTCGTGAA

GATCT CTCAG CCAGG GGCCA GTCAA GTGTA TCACA GATTC TGTGA

2.3.3 N10和D10樣品測序圖如下。

2.4 GNB3 A(-350)G位點統(tǒng)計學(xué)分析

表1 GNB3 A(-350)G位點等位基因頻率結(jié)果

表2 GNB3 A(-350)G位點基因型頻率結(jié)果

3 討論

原發(fā)性高血壓是一種由多種遺傳和環(huán)境因素共同作用所致的復(fù)雜的多基因疾病，而且遺傳因素在高血壓人群中可能起著重要的不可忽視的作用。近年來，尋找與高血壓病有關(guān)及致病的相關(guān)基因越來越受到人們的關(guān)注。1998年，Siffert等發(fā)現(xiàn)G蛋白β3亞單位(GNB3)基因第10位外顯子存在一個多態(tài)位點C825T。T等位基因使G蛋白過度活化，使得細胞Na+/H+交換(NHE)增強，Na+重吸收增加，容量擴張，導(dǎo)致血管強烈收縮及平滑肌增殖，使患高血壓及高血壓相關(guān)器官損害危險增加[4]。GNB3基因多態(tài)性與高血壓的關(guān)系存在種族差異，對不同種族人群進行的研究結(jié)果不盡一致，我們的研究結(jié)果也顯示GNB3基因A(-350)G多態(tài)性的變化存在著種族差異。由表1、表2可見，廣東地區(qū)正常和患患者群G等位基因頻率(1.000和0.978)顯著高于非洲地區(qū)和德國地區(qū)正常人群G等位基因頻率(0.76和0.61)，而A等位基因頻率(0和0.022)顯著低于非洲地區(qū)和德國地區(qū)正常人群A等位基因頻率(0.24和0.39)，這可能與不同種族內(nèi)心血管系統(tǒng)疾病患病率的高低存在相關(guān)性。所以在白人、黑人和東亞人群中GNB3基因A(-350)G位點等位基因頻率是顯著不同的，而亞洲人分布是否相似還有待于進一步深入研究。經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析，本次研究高血壓組與正常血壓組的GNB3 A(-350)G位點基因型與等位基因型無顯著性差異，當(dāng)然，為了進一步確定其關(guān)系，需要更多實驗研究和更大的樣本含量，并進行家族分析。

[1]劉文娟，楊文清，王蕾，等.β2腎上腺素受體基因、α上皮細胞鈉通道基因和G蛋白β3亞基基因聯(lián)合變異與維吾爾族人群高血壓的關(guān)系.中國循環(huán)雜志，2009，24(6):446-450.

[2]Adam V，Benjadield，Chery，et al.G-protein β3 subunit gene(GNB3)variant in causation of essential hypertension.Hypertension，1998，32(5):994.

[3]Kato.Association study of G-protein β3 subunit.Hypertension，1998，32(5):934.

[4]韓璐璐，李娜，蔣雄京，等.GNB3基因C825T多態(tài)性與美托洛爾藥效的相關(guān)性研究.中國新藥雜志，2010，19(9).