何云松，龍漢武，潘高潮，鄒方倫＊＊

(1.貴州省生物研究所，貴州 貴陽 550009;2.貴州省山地資源研究所，貴州 貴陽 550002)

紅托竹蓀Dictyophora rubrovolota Zang，是藏穆先生1976年在《云南植物研究》發(fā)表的一個新種。在自然環(huán)境生態(tài)條件下，竹蓀主要靠孢子繁殖，孢子借助于昆蟲的傳播，在適宜的條件下，孢子萌發(fā)形成菌絲體，菌絲體通過營養(yǎng)生長達到生理成熟后最終形成子實體。紅托竹蓀在貴州漫長的栽培過程中，出現了嚴重的菌種退化，導致上千畝的紅托竹蓀減產甚至絕收。因此培育優(yōu)良紅托竹蓀菌種是人工栽培成功的關鍵，要培育優(yōu)良菌種就必需了解紅托竹蓀生長所需的環(huán)境條件和生長基物，只有了解掌握了紅托竹蓀的生態(tài)習性[1]，才能培育出優(yōu)良的菌種并在適宜的低溫條件下進行保藏。本項目從紅托竹蓀一級菌種培養(yǎng)基的配方篩選、菌種分離培養(yǎng);二級、三級菌種的培養(yǎng)基的配方篩選、菌種保藏的適宜溫度、保藏菌種的菌絲萌發(fā)試驗、菌種的轉接擴大培養(yǎng)及栽培岀菇等方面展開研究。

1 紅托竹蓀的菌種制作

1.1 紅托竹蓀一級菌種培養(yǎng)基的配方及制備

培養(yǎng)基配方:鮮松針 (馬尾松松針)100 g、馬鈴薯 (去皮)200 g、蔗糖20 g、瓊脂 18 g～20 g、H2O 1 000 mL，pH 7.5～8.0。

培養(yǎng)基的制備:先將馬鈴薯去皮，沖洗，取200 g，切成薄片，加水500 mL，溫火煮沸至薯塊酥而不爛為止，然后4層濕潤沙布過濾，取濾液備用。將松針100 g放入500 mL水中煮沸15 min，用4層濕潤的紗布過濾，取濾液備用。

把馬鈴薯浸出液與松針浸出液合并，補足1 000 mL，在合并溶液中加瓊脂20 g、蔗糖20 g，煮沸，調節(jié)pH值至pH 7.5～8.0。趁熱分裝試管后進行消毒滅菌，高壓蒸汽滅菌1 kg·cm－2，121℃滅菌40 min后，取出割成斜面?zhèn)溆谩?/p>

1.2 紅托竹蓀一級菌種的分離

大型真菌菌種常用的分離方法有孢子分離法、組織分離法和菇木分離法3種。紅托竹蓀菌種的分離以組織分離為主，選取5成～6成熟未開的竹蓀菌蛋 (以野生資源采集的竹蓀菌蛋為最佳)作為分離竹蓀菌種用，將竹蓀菌蛋去掉泥沙，放入無菌工作臺內，用75%酒精棉球擦拭竹蓀菌蛋進行表面消毒。用解剖刀從竹蓀菌蛋中部切開，把竹蓀菌蛋切成兩半，把切開的竹蓀菌蛋中部白色部分 (即竹蓀菌柄與菌裙部分)挑取一小塊組織，移接到斜面培養(yǎng)基上，置于23℃左右培養(yǎng)，經過5 d～7 d培養(yǎng)后，可看到組織塊上產生白色絨毛狀菌絲，待菌絲長滿斜面試管后，再經過一次轉管擴大培養(yǎng)，即得竹蓀母種。

1.3 二級、三級菌種的配方及制備

1.3.1 枝條菌種培養(yǎng)基配方

樹枝以直徑0.5 cm～1 cm的毛栗、山楊柳最為適宜 (圖1)。配方為樹枝條75%、米糠 (麥麩)15%、黃豆粉5%、白糖2%、石膏1.5%、過磷酸鈣1.5%，pH值為8.0～8.5，H2O適量。

枝條先用清水浸泡24 h，以枝條浸透水分為宜。

圖1 保藏菌種原料樹枝條

1.3.2 配料

將樹枝條、米糠 (或麥麩)、黃豆粉、白糖、石膏、過磷酸鈣分別充分攪拌均勻。含水量調至60%～65%，pH 7.5～8，若酸度過高，可用石灰水調節(jié)。

1.3.3 裝瓶

采用500 mL標準三角瓶，將配好的培養(yǎng)料裝入三角瓶內，邊裝邊搖動，盡量減少空隙，料裝至三角瓶高度的3/4為宜，清洗三角瓶外表面和瓶口，塞上棉塞 (圖2)。

圖2 裝料完畢的三角瓶

1.3.4 滅菌

將裝好料的三角瓶放入滅菌鍋內，以1.5 kg·m－2壓力滅菌1.5 h或在常壓下滅菌8 h，悶2 h。滅菌完成后，趁熱放入接種工作臺或接種室備用。

1.3.5 接種

待料溫降至30℃以下時，無菌操作，向三角瓶內接入菌種，為防止菌種干縮，接種時應盡量將菌種埋入培養(yǎng)料內。

1.3.6 培養(yǎng)

將接種后的三角瓶放入培養(yǎng)箱或培養(yǎng)室內培養(yǎng)，溫度保持在22℃～24℃。待三角瓶內培養(yǎng)料長滿菌絲后，將其放在4℃的溫度下保藏4年 (圖3)。

圖3 保藏了4年的三角瓶菌種

1.4 保藏4年的紅托竹蓀菌種萌發(fā)試驗

將保藏4年的紅托竹蓀枝條菌種切開放入培養(yǎng)皿內，并在培養(yǎng)皿內放入吸水飽和的脫脂棉 (圖4)，放入溫度24℃的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，保藏菌種培養(yǎng)20 d后，菌絲萌發(fā)，生長狀況良好 (圖5)。

圖4 保藏4年的枝條菌種

圖5 培養(yǎng)20 d的保藏菌種

1.5 紅托竹蓀保藏菌種的轉接擴大培養(yǎng)

紅托竹蓀保藏菌種通過菌絲萌發(fā)試驗證明菌種活性良好，需要進行菌種轉接擴大培養(yǎng)，并進行岀菇試驗，才能證明該菌種是優(yōu)良菌種。

1.5.1 木屑麥麩培養(yǎng)基

木屑70%、麥麩或米糠20%、黃豆粉5%、白糖2%、石膏1.5%、過磷酸鈣1.5%，pH值為8.0～8.5，H2O適量。

將5.1配方原料充分攪拌均勻。含水量調至60%～65%，pH8.0～8.5，若酸度過高，可用石灰水調節(jié)，原料裝瓶、滅菌、接種、培養(yǎng)均參照以上3.3、3.4、3.5、3.6的操作。

1.5.2 栽培岀菇

栽培原料以玉米芯和黃豆桿為主要原料進行栽培，原料用石灰水浸泡12 h后，用清水沖洗至pH為8.5即可播種覆土栽培。后期的菌絲生長管理、岀菇、采收、產品加工等參照竹蓀栽培[2]。紅托竹蓀保藏菌種栽培岀菇情況見圖6。

圖6 紅托竹蓀保藏菌種栽培岀菇

1.6 結果與討論

紅托竹蓀與其它竹蓀品種比較，其特點是竹蓀菌蛋、菌索以及菌絲受傷后變紫色，這是紅托竹蓀與其它竹蓀的主要區(qū)別。根據栽培岀菇情況圖6顯示，采用枝條保藏紅托竹蓀菌種保藏4年后，其紅托竹蓀原有的菌托和菌索受傷變紫色的性狀仍然保持，為紅托竹蓀保藏菌種采用秸稈栽培推廣栽培提供了堅實的基礎和依據。有關紅托竹蓀保藏菌種栽培的竹蓀子實體氨基酸含量及營養(yǎng)成分的測定有待進一步研究。

[1]鄒方倫.貴州竹蓀資源及生態(tài)的研究 [J].貴州農業(yè)科學，1994(3):43－47.

[2]鄒方倫，宋培浪，王波，等.貴州特色菌物和珍稀菌類的栽培與馴化研究[M].貴陽:貴州科技出版社，2007.