毛麗紅，李慶華，韓 康，王瑞莉，龔方華，薛樂勛1，#

1)鄭州大學(xué)生物工程系細(xì)胞生物學(xué)研究室 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院細(xì)胞生物學(xué)研究室 鄭州 450052

糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase 3，GSK3)是一種多功能的絲/蘇氨酸蛋白激酶，它可以抑制糖原合成酶的活性，導(dǎo)致胰島素抵抗，從而調(diào)節(jié)體內(nèi)糖代謝水平[1]。GSK3還在Wnt信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用，它通過與APC、Axin、CK1和β-catenin形成復(fù)合體，使β-catenin發(fā)生磷酸化，從而影響下游轉(zhuǎn)錄因子[2]。它還參與Hedgehog、Notch、mTOR等其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并對(duì)各種細(xì)胞過程進(jìn)行調(diào)控，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)元功能及胚胎發(fā)育等[3-4]。鞭毛是廣泛存在于多種細(xì)胞表面、結(jié)構(gòu)保守的細(xì)胞器，它在介導(dǎo)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、感知外界環(huán)境及胞內(nèi)信號(hào)傳遞的過程中發(fā)揮重要作用。鞭毛的組裝是一個(gè)雙向的、動(dòng)態(tài)的組裝過程，非常有利于鞭毛維持在合適的長(zhǎng)度[5]。然而一旦這個(gè)過程發(fā)生異常，鞭毛出現(xiàn)缺陷或丟失，就有可能引發(fā)多種疾病，如多囊腎、癌癥等。因此研究鞭毛長(zhǎng)度調(diào)控機(jī)制對(duì)了解這些疾病的發(fā)生具有重要的意義。目前已有研究[6]證明，采用GSK3的抑制劑LiCl能夠使衣藻鞭毛延長(zhǎng)，表明衣藻中GSK3對(duì)鞭毛組裝和維持鞭毛長(zhǎng)度具有一定的調(diào)控作用。杜氏鹽藻作為一種高度耐鹽的單細(xì)胞綠藻，具有一對(duì)等長(zhǎng)的鞭毛，且易于觀察研究。該研究克隆杜氏鹽藻GSK3 cDNA序列，并通過實(shí)時(shí)熒光定量的方法初步探討杜氏鹽藻GSK3與鞭毛的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1藻株與培養(yǎng)杜氏鹽藻UTEX LB-1644購(gòu)自美國(guó)德克薩斯州大學(xué)，采用改良型液體培養(yǎng)基于26 ℃、4 500 Lux光照強(qiáng)度下在HPG光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光暗周期各為12 h。

1.2主要試劑限制性內(nèi)切酶、3’RACE試劑盒、T4 DNA連接酶和pMD18-T載體均購(gòu)自TaKaRa公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為Fermentas公司產(chǎn)品，實(shí)時(shí)熒光定量染料購(gòu)自全式金公司。

1.3杜氏鹽藻GSK3cDNA片段的克隆與鑒定

1.3.1 總cDNA模板的制備 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期鹽藻細(xì)胞10 mL，1 000 r/min離心10 min收集細(xì)胞，培養(yǎng)基洗滌2遍后離心收集細(xì)胞于無RNase離心管中。Trizol裂解法提取鹽藻總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)檢測(cè)所提RNA的質(zhì)量和濃度。最后按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA模板。

1.3.2 GSK3基因片段的擴(kuò)增 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的2個(gè)短片段分別設(shè)計(jì)上下游引物：上游 5’-TGG TGGATGGGGACCTCA-3’(18 bp)，下游 5’-GCCGCC GAAGATGAGCTC-3’(18 bp)。PCR擴(kuò)增兩片段間的序列，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，50～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min；反應(yīng)30個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后膠回收，回收片段與pMD18-T載體16 ℃過夜連接。然后轉(zhuǎn)化E.coliDH5α進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取陽性單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定，取插入片段大小正確的單克隆菌液送測(cè)序，進(jìn)一步進(jìn)行鑒定。

1.3.3 3’RACE法擴(kuò)增GSK3 3’端序列 根據(jù)已擴(kuò)增的GSK3片段設(shè)計(jì)3’RACE上游引物：外側(cè)5’-CCTGGTGCTGGAGTTCGT-3’(18 bp)，內(nèi)側(cè)5’-ACTA

CACTGCTGCCATTGAT-3’(20 bp)。下游引物為3’RACE試劑盒自帶的引物：外側(cè) 5’-TACCGTCGTTC

CACTAGTGATTT-3’(23 bp)和內(nèi)側(cè) 5’-CGCGGATCC TCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3’(32 bp)。提取鹽藻總RNA，使用3’RACE 接頭引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄制備模板，按試劑盒說明上的程序進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、膠回收、連接及轉(zhuǎn)化后，提取質(zhì)粒，EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定正確的單克隆菌樣送測(cè)序。

1.3.4 利用抑制消減雜交模板擴(kuò)增5’端序列 將Tester cDNA模板PCR 引物5’-AAGCAGTGGTATCA ACGCAGAGTAC-3’(25 bp)作為上游引物。根據(jù)已知片段設(shè)計(jì)的特異性引物：外側(cè)5’-ACTCTGCCACC ACGCAGC-3’(18 bp)，內(nèi)側(cè)5’-AGGAGCACGGTAG TAACG-3’(18 bp)，作為下游引物。以Tester cDNA為模板，按常規(guī)反應(yīng)體系和程序進(jìn)行巢式PCR，所得片段連入載體后，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，質(zhì)粒提取，EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定，最后送測(cè)序。

1.3.5 GSK3 cDNA總長(zhǎng)的驗(yàn)證 根據(jù)拼接后cDNA片段兩端序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增得到GSK3 cDNA總長(zhǎng)，回收后連入pMD18-T載體，質(zhì)粒用BamHⅠ、HindⅢ酶切鑒定后送測(cè)序。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)GSK3在鞭毛再生中的變化采用pH休克法脫去杜氏鹽藻鞭毛[7]，在去鞭毛后的300 min內(nèi)，每隔30 min取一次鹽藻，將其收集于無RNase離心管中，加Trizol裂解提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計(jì)引物：上游5’-GGGGCAAACAAGCAGACG-3’(18 bp)，下游5’-CG GATGGTCCACCATCTT-3’(18 bp)，以GAPDH作為內(nèi)參，未脫鞭毛鹽藻作為對(duì)照，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，導(dǎo)出數(shù)據(jù)計(jì)算2-ΔΔCt值進(jìn)行定量分析，其中Ct為擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1杜氏鹽藻GSK3cDNA片段結(jié)果分析

2.1.1 GSK3片段的擴(kuò)增及鑒定 PCR擴(kuò)增得到一段長(zhǎng)為605 bp的序列(圖1A)，大小與推測(cè)值相符。膠回收后與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化后提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果見圖1B。

圖1 GSK3片段的擴(kuò)增和鑒定結(jié)果

A：PCR結(jié)果；B：雙酶切鑒定結(jié)果；M：Marker；1：GSK3；2：pMD18-T-GSK3；3：pMD18-T和GSK3。

2.1.2 3’RACE和5’端cDNA序列擴(kuò)增結(jié)果 3’RACE PCR擴(kuò)增得到長(zhǎng)為1 195 bp片段(圖2A)，測(cè)序結(jié)果顯示含完整的polyA尾，回收片段與pMD18-T載體連接，質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定，結(jié)果見圖2B。5’端PCR擴(kuò)增得到899 bp片段(圖3A)，酶切鑒定結(jié)果見圖3B。

圖2 3’RACE擴(kuò)增和鑒定結(jié)果

A：PCR結(jié)果；B：雙酶切鑒定結(jié)果；M：Marker；1：3’RACE PCR產(chǎn)物；2：pMD18-T-3’GSK3；3：pMD18-T和3’GSK3。

圖3 5’端cDNA擴(kuò)增和鑒定結(jié)果

A：PCR結(jié)果；B：雙酶切鑒定結(jié)果；M：Marker；1：5’端PCR產(chǎn)物；2：pMD18-T-5’GSK3；3：pMD18-T和5’GSK3。

2.1.3 GSK3 cDNA總長(zhǎng)序列分析結(jié)果 拼接后得到GSK3 cDNA總長(zhǎng)為2 116 bp(圖4)，其中包括737 bp的3’UTR和1 158 bp的開放閱讀框，編碼386個(gè)氨基酸。氨基酸序列經(jīng)比對(duì)后與萊茵衣藻的同源性為86%。

圖4 GSK3 cDNA總長(zhǎng)的擴(kuò)增結(jié)果

2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果與未脫鞭毛組相比，在去鞭毛后的300 min內(nèi)GSK3基因轉(zhuǎn)錄量明顯升高，并在120 min時(shí)達(dá)到最高水平(圖5)。

圖5 GSK3實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果

3 討論

杜氏鹽藻是一種無細(xì)胞壁的單細(xì)胞真核綠藻，具有一對(duì)等長(zhǎng)的鞭毛[8]，長(zhǎng)度約為13 μm，鞭毛具有典型的“9+2”結(jié)構(gòu)。因其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，生長(zhǎng)周期短，鞭毛形態(tài)易于觀察，所以非常適合作為研究鞭毛/纖毛長(zhǎng)度調(diào)控機(jī)制的模型生物。然而，由于杜氏鹽藻的基因組序列尚未公布，且已得到全序列的鞭毛相關(guān)基因較少，因此給鞭毛調(diào)控機(jī)制和功能的研究帶來了諸多不便。該研究通過擴(kuò)增GSK3 cDNA序列，得到了完整的開放閱讀框，編碼386個(gè)氨基酸，經(jīng)在NCBI上比對(duì)發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列與衣藻、團(tuán)藻等具有較高的同源性，說明GSK3在不同物種中高度保守，而這種高保守性也正是GSK3維持自身激酶活性所必需的。

一直以來，關(guān)于GSK3的研究層出不窮，作為一個(gè)多功能基因，它不僅是維持體內(nèi)糖代謝的關(guān)鍵酶，而且還是多種細(xì)胞信號(hào)通路的關(guān)鍵因子。GSK3還可以通過使微管相關(guān)蛋白Tau、MAP-1B和APC發(fā)生磷酸化來調(diào)控微管的動(dòng)力學(xué)作用，從而影響軸索的生長(zhǎng)[9]。另外，GSK3可以通過分解驅(qū)動(dòng)蛋白1，進(jìn)而選擇性地抑制順向軸絲運(yùn)輸及其與貨物蛋白間的相互作用[10]。雖然這些研究已經(jīng)證明GSK3對(duì)維持微管的穩(wěn)定性及鞭毛內(nèi)運(yùn)輸具有一定的調(diào)控作用，但對(duì)于它在鞭毛生長(zhǎng)中的作用以及長(zhǎng)度調(diào)控的機(jī)制目前尚不清楚。所以，作者通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法研究了GSK3在轉(zhuǎn)錄水平上與鞭毛再生的關(guān)系，結(jié)果顯示GSK3的轉(zhuǎn)錄量明顯升高，甚至比對(duì)照組高20多倍，表明GSK3在鞭毛再生中發(fā)揮重要作用。雖然已有研究[6]表明，GSK3的活性形式在鞭毛內(nèi)大量存在且其活性抑制劑LiCl能夠使衣藻鞭毛延長(zhǎng)。但是，在杜氏鹽藻中，鋰處理后鞭毛長(zhǎng)度并未出現(xiàn)明顯的延伸，因此，作者推測(cè)杜氏鹽藻GSK3可能不參與鞭毛長(zhǎng)度的維持，只是在鞭毛生長(zhǎng)過程中發(fā)揮調(diào)控作用。另外，GSK3是否通過參與鞭毛內(nèi)某種信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)對(duì)鞭毛生長(zhǎng)的調(diào)控以及它在鞭毛再生中是否還發(fā)揮其他未知的功能，這還需要進(jìn)一步的研究才能證實(shí)。

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