徐洪軍 李曉瑩 韓 笑 安麗萍 王海莉 關(guān)曉輝

(北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132001)

P53凋亡刺激蛋白(ASPP)家族包括3個(gè)成員:ASPP1，ASPP2和iASPP〔1〕。ASPP1和 ASPP2蛋白與 P53結(jié)合后能激活P53的抑癌功能，iASPP與P53結(jié)合后可抑制P53的抑癌功能。本研究利用生物信息學(xué)軟件分析人iASPP蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性、疏水性和抗原性等理化性質(zhì)，制備多克隆抗體，分析其與結(jié)腸癌分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 iASPP抗原與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 iASPP抗原由本實(shí)驗(yàn)室制備，新西蘭大白兔購(gòu)自吉林省生物制品所。

1.1.2 資料選擇 選取北華大學(xué)附屬醫(yī)院2005年1月至2010年12月住院手術(shù)治療的結(jié)腸癌病人樣本30例，其中男16例，女14例，年齡40～75(平均57.5)歲。正常結(jié)腸黏膜15例。標(biāo)本來自北華大學(xué)附屬醫(yī)院病理科保存的蠟塊。

1.1.3 試劑盒 S-P免疫組織化學(xué)染色試劑盒為美國(guó)Zymed公司產(chǎn)品，購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司。Western印跡、ELISA試劑盒，購(gòu)自北京西美杰生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 主要試劑 完全和不完全弗氏佐劑購(gòu)自北京鼎國(guó)生物公司;人iASPP蛋白和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG抗體購(gòu)自Santa Cruz公司;化學(xué)發(fā)光法(ECL)試劑盒購(gòu)自Amersham公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 登錄進(jìn)入http://www.ncbi.nlm.nih.gov，采用Blastn和Blastx程序，進(jìn)行同源性檢索和保守性分析。采用ProtScale程序、ExPASy工具包程序、SWISS PROT蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)和DNA star(Protean)生物信息學(xué)軟件對(duì)iASPP的二級(jí)結(jié)構(gòu)、抗原性、親疏水性、結(jié)合位點(diǎn)、氨基酸的帶電性等理化性質(zhì)進(jìn)行分析。

1.2.2 iASPP多肽的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)生物信息學(xué)分析和預(yù)測(cè)，按抗原性、親疏水性和同源性分析，設(shè)計(jì)并合成一段多肽，即iASPP:NH2-TAFEKCDPYREGYADCATYL-COOH。多肽的合成與載體蛋白-血藍(lán)素聯(lián)接交由北京博奧森生物技術(shù)有限公司完成。多肽的合成采用9-氟甲氧羰基(Fmoc)固相合成法，利用高效液相法進(jìn)行純化，純化后的樣品再用高效液相色譜法(HPLC)分析，純度為95%。

1.2.3 動(dòng)物免疫 將純化后的多肽抗原液250 μl與等體積的弗氏完全佐劑混合，充分乳化后采用背部多點(diǎn)注射法免疫新西蘭白兔。2 w后取多肽抗原液加等體積弗氏不完全佐劑相同方法加強(qiáng)免疫，以后每2周免疫1次，共5次，末次免疫后5～7 d于耳緣靜脈取血，間接ELISA方法檢測(cè)血清達(dá)理想效價(jià)后頸動(dòng)脈放血，收集兔血清。

1.2.4 免疫兔血清采集及純化 采用頸總動(dòng)脈放血法收集兔血清。鹽析法初步純化兔血清。

1.2.5 間接ELISA方法測(cè)定血清效價(jià) 于注射免疫程序開始前和每次注射免疫后1 w，從兔耳緣靜脈取血1 ml，離心取上清測(cè)定血清效價(jià)。經(jīng)過包被、洗滌、封閉、洗滌、加一抗、洗滌、加二抗、洗滌、顯色、終止反應(yīng)等過程。酶標(biāo)儀測(cè)定A492值，以(被檢標(biāo)本值－空白值)/(陰性對(duì)照值－空白值)即P/N≥2.1為陽(yáng)性。

1.2.6 多克隆抗體的Western印跡鑒定 蛋白采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)轉(zhuǎn)膜，以純化的免疫兔血清為一抗，羊抗兔HRP-IgG抗體為二抗，以免疫前兔血清為陰性對(duì)照，通過ECL顯色系統(tǒng)進(jìn)行Western印跡檢測(cè)。

1.2.7 免疫組織化學(xué) 取組織切片，應(yīng)用過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素染色進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色(S-P法):切片脫蠟，水化，水浴法抗原修復(fù)，3%H2O2阻斷內(nèi)源性氧化物酶活性。正常血清孵育，滴加 ASPP1抗體，4℃過夜，依次經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，孵育，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色后，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。結(jié)果判斷:用PBS代替一抗作陰性對(duì)照，用已知的陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照。染色結(jié)果判定以腫瘤細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，高倍鏡下取4個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比將染色結(jié)果分為:陽(yáng)性細(xì)胞＜5%為(－);5% ～25%為(+);25% ～50%為(?);＞50%為(?)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，采用計(jì)數(shù)資料四格表及四格表的確切概率法、相關(guān)分析等。

2 結(jié)果

2.1 多肽抗體的制備和效價(jià) iASPP肽段具有良好的免疫原性，在接受第1次免疫后2 w，體內(nèi)抗體滴度開始上升，5次主動(dòng)免疫結(jié)束后即第9周，兔抗血清與多肽抗原發(fā)生強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，對(duì)照組兔血清不與多肽發(fā)生免疫反應(yīng)。家兔免疫后獲得的血清進(jìn)行倍比稀釋，隨著血清稀釋度的增加，其反應(yīng)孔OD值降低，以 P/N≥2.1為陽(yáng)性，間接 ELISA測(cè)定效價(jià)均大于1∶160 000，表明獲得高效價(jià)的多抗。

2.2 多肽抗體的特異性 Western印跡分析結(jié)果顯示轉(zhuǎn)印至PVDF膜上的iASPP蛋白與免疫兔血清形成單一陽(yáng)性染色帶，與其蛋白分子量的理論值相符，兔陰性對(duì)照血清無條帶出現(xiàn)，表明獲得了抗iASPP的多克隆抗體。

2.3 iASPP與結(jié)腸癌的組織分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的差異性及其在組織中的表達(dá) 癌組織不同分化程度者iASPP陽(yáng)性率差異顯著(P＜0.05);在不同浸潤(rùn)深度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者間iASPP表達(dá)無顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)腸癌組織中iASPP的陽(yáng)性表達(dá)率高于正常結(jié)腸組織(P＜0.05)。見表1，圖 1。

表1 iASPP陽(yáng)性表達(dá)與結(jié)腸癌的組織分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系〔n(%)〕

圖1 iASPP免疫組化結(jié)果(×10)

3 討論

結(jié)腸癌以41～51歲發(fā)病率最高，從病因看大多數(shù)來自腺瘤癌變，在形態(tài)學(xué)上可見到炎癥、增生、腺瘤、癌變各個(gè)階段以及其對(duì)應(yīng)的染色體改變。多種因素相互作用的結(jié)果導(dǎo)致了結(jié)腸癌的發(fā)生，其中結(jié)腸腺瘤是結(jié)腸癌發(fā)生的重要病因之一〔2〕。結(jié)腸癌的腺瘤-癌序列學(xué)說中，細(xì)胞增殖與凋亡失衡是結(jié)腸癌發(fā)生的重要機(jī)制。

P53是現(xiàn)今公認(rèn)的與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)性最高的抑癌基因之一〔3〕，近年新發(fā)現(xiàn)的ASPP蛋白家族，對(duì)P53起調(diào)控作用。其作用機(jī)制為:ASPP與P53結(jié)合形成ASPP-P53復(fù)合物作用于原凋亡基因啟動(dòng)子，ASPP的微小變化就可引起P53結(jié)合DNA的能力發(fā)生改變，從而影響P53誘導(dǎo)凋亡的能力。ASPP1，ASPP2與iASPP作用相反，iASPP是與ASPP1和ASPP2競(jìng)爭(zhēng)P53的結(jié)合位點(diǎn)，影響ASPP-P53復(fù)合物與DNA結(jié)合的能力，從而阻止P53 的細(xì)胞凋亡功能〔4，5〕。

劉航等〔6〕對(duì)野生型P53和ASPP蛋白水平正常的8例乳腺癌患者的iASPP蛋白含量進(jìn)行系統(tǒng)檢測(cè)，測(cè)試結(jié)果有7例患者的iASPP含量都比較高。在急性白血病患者細(xì)胞中，Zhang等〔4，7，8〕的研究發(fā)現(xiàn) iASPP mRNA 表達(dá)水平比正常者及急性白血病完全緩解者要高很多。在白血病細(xì)胞中，Liu等〔9，10〕研究發(fā)現(xiàn)ASPP1及ASPP2的mRNA低表達(dá)與iASPP的mRNA高表達(dá)共存的現(xiàn)象，闡述了ASPP1和ASPP2的表達(dá)升高和iASPP的表達(dá)下調(diào)，也許在白血病發(fā)病機(jī)制中起重要作用。

以上的研究證明，ASPP蛋白是體內(nèi)P53的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，ASPP1和ASPP2通過提高原凋亡基因的活力促進(jìn)P53依賴的細(xì)胞死亡，而iASPP與其作用相反。該基因家族與腫瘤的關(guān)系具有普遍意義。有文獻(xiàn)報(bào)道，在正常成人組織中，iASPP有低表達(dá)，而其他癌組織中，iASPP表達(dá)較為活躍，這與本研究結(jié)果部分相符。導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能與很多因素有關(guān)，還需繼續(xù)研究與探討。

綜上，可以考慮通過提高ASPP1，ASPP2的高表達(dá)，抑制iASPP的表達(dá)來提高野生型P53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能，達(dá)到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤的作用。

1 陳燕平，劉澤軍.ASPP蛋白家族在腫瘤細(xì)胞凋亡中的作用〔J〕.癌變、畸變突變，2006;6:488-90.

2 陳 坤，舒國(guó)通，馬新源，等.腸息肉與結(jié)直腸癌發(fā)病關(guān)系隊(duì)列研究〔J〕.中國(guó)公共衛(wèi)生，2004;20(2):168-70.

3 胡紅艷，魏萬里.ASPP基因家族與腫瘤的研究進(jìn)展〔J〕.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2009;25(15):2593-5.

4 方贊熙，黃如欣，張忠英.P53凋亡刺激蛋白抑制因子的研究進(jìn)展〔J〕.醫(yī)學(xué)綜述，2007;13(9):661-2.

5 張 云，劉澤軍.新的抑癌基因ASPP對(duì)P53作用的研究進(jìn)展〔J〕.生命科學(xué)，2004;16(2):79-80.

6 劉 航，王 敏.P53調(diào)節(jié)蛋白ASPPs的分子生物學(xué)特性及其與腫瘤的關(guān)系〔J〕.醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志，2007;4(5):427-30.

7 張 云，劉澤軍，李 維，等.腫瘤細(xì)胞中ASPP2 mRNA的表達(dá)及意義〔J〕.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003;25(23):2103-5.

8 Zhang X，Wang M，Zhou C，et al.The expression of iASPP in acute leukemias〔J〕.Leuk Res，2005;29(2):179-83.

9 Liu ZJ，Zhang Y，Zhang XB，et al.Abnormal mRNA expression of ASPP members in leukemia cell lines〔J〕.Leukemia，2004;18(4):880.

10 張 云，劉澤軍，劉 彬，等.抑癌基因ASPP家族在腫瘤細(xì)胞株中的表達(dá)研究〔J〕.臨床血液學(xué)雜志(輸血與檢驗(yàn)版)，2009;22(1):78-80.