徐 靜 姚榮妹 馬會霞 李 潔 韓淑英 包巨太

(河北聯(lián)合大學(xué)2011級碩士研究生，河北 唐山 063000)

抗柯薩奇B病毒性心肌炎膠囊(K-CoxB-JN)復(fù)方是本課題組(抗柯薩奇B病毒性心肌炎膠囊活性成分的提取及其優(yōu)化研究)開發(fā)的一種中藥制劑。本課題組前期實驗表明，抗柯薩奇B中藥膠囊可以提高患者抵抗力，增強免疫功能，激活自然殺傷(NK)細胞細胞活性[1]。通過正交試驗證實，K-CoxB-JN優(yōu)化方與原方都具有相似的提高小鼠抗應(yīng)激反應(yīng)能力的作用[2]，但此方臨床應(yīng)用劑量較大，因此本課題組對該復(fù)方進行了新的工藝提取，研制出K-CoxB-JN復(fù)方新制劑，實驗證明K-CoxB-JN復(fù)方新制劑對病毒性心肌炎具有較好的效果[3-5]。本實驗擬通過柯薩奇B3(CVB3)病毒感染人喉癌上皮(Hep-2)細胞，觀察不同濃度K-CoxB-JN復(fù)方新制劑對CVB3感染Hep-2細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞與病毒 Hep-2細胞與CVB3病毒均由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所ABSL-2生物安全實驗室惠贈。

1.1.2 實驗藥物 K-CoxB-JN復(fù)方新制劑(藥物組成：西洋參、黃芪、牡丹皮、麥門冬、北五味子、萊菔子及王不留行)，按處方量取復(fù)方藥物10劑，加10倍量70%乙醇，回流提取2次，每次1.5 h，濾過，合并提取液，濃縮后藥液離心，收取沉淀，減壓干燥成干膏；乙醇提取后的藥渣，水煎煮3次，加水量分別10、8、8倍，每次1.5 h，合并水煎液減壓濃縮，加乙醇至含醇量60%，放置過夜，離心，取沉淀，用等容積95%乙醇清洗2次，減壓干燥成干膏。合并兩部分干膏，粉碎，混合，分裝，每粒含0.4 g，相當生藥量4 g，由頸復(fù)康藥業(yè)集團有限公司負責加工提供。利巴韋林顆粒，四川百利藥業(yè)有限責任公司，國藥準字H51023508。

1.1.3 儀器與試劑 生物安全柜(美國Thermo Scientific公司)；超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；Thermo 371型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)；Eppendorf離心機(德國Eppendorf公司)；Olympus倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；Rayto RT-6000酶標儀(美國Rayto雷杜公司)；特級胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；溴化噻唑藍四氮唑(MTT，美國Sigma公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 CVB3病毒擴增 將生長良好的Hep-2細胞，接種于一次性培養(yǎng)瓶，當細胞長至80%左右時，更換為細胞維持液(含2%胎牛血清)，加CVB3病毒液100 μL/瓶，置37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞病變達到75%后，收集細胞，重復(fù)凍融3次，以1 500 r/min離心30 min，吸取含病毒的上清液，分裝，置超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 CVB3病毒毒力滴定(TCID50測定)[6]將Hep-2細胞配制成濃度為104/mL的細胞懸液，加入96孔培養(yǎng)板中，當細胞長至80%左右時，棄培養(yǎng)板中的生長液，以PBS緩沖液洗滌各培養(yǎng)孔1次。用含2%胎牛血清的維持液，將CVB3病毒以10倍濃度從10-1稀釋到10-8，加入96孔板中，每孔100 μL，每個濃度設(shè)4個復(fù)孔，另設(shè)4個正常對照孔各加100 μL的2%細胞維持液，置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后觀察細胞病變情況，按Reed-Muench法計算TCID50為10-7.5/0.1 mL。

1.2.3 藥物毒性實驗[7]將生長良好的Hep-2細胞經(jīng)胰酶消化后，稀釋成濃度為104/mL的細胞懸液，接種于96孔板中，當細胞長至80%左右時，棄培養(yǎng)板中的生長液，以PBS緩沖液洗滌各培養(yǎng)孔1次。用含2%胎牛血清的維持液將K-CoxB-JN復(fù)方新制劑和利巴韋林顆粒從原液25 mg/mL開始配制成8個濃度，即原液、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128，8個濃度，用一次性濾器濾過，將不同濃度的藥物加入96孔板中的細胞中，每孔200 μL，每個濃度設(shè)4個復(fù)孔，另設(shè)4個加2%細胞維持液的正常對照孔，置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24、48 h觀察細胞生長狀態(tài)，參考正常對照孔細胞形態(tài)，觀察細胞病變，以不引起細胞病變的最大藥物稀釋濃度為最大無毒濃度(TC0)。-表示無細胞病變，+表示細胞病變?yōu)?%～25%，++表示細胞病變?yōu)?5%～50%，+++表示細胞病變?yōu)?0%～75%，++++表示細胞病變?yōu)?5%～100%。

1.2.4 藥物對細胞的保護作用 將Hep-2細胞配制成濃度為104/mL的細胞懸液，加入96孔培養(yǎng)板中，24 h后加入從藥物TC0起始稀釋4個濃度的K-CoxB-JN復(fù)方新制劑(原液、1∶2、1∶4、1∶8)及利巴韋林顆粒(原液、1∶2、1∶4、1∶8)的生長液，每孔100 μL，每個濃度設(shè)4個復(fù)孔，正常對照組和病毒對照組加100 μL含2%胎牛血清的細胞維持液，放入37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 h后給藥組和病毒對照組加入100 TCID50的CVB3病毒液，每孔100 μL，正常對照組加100 μL的2%細胞維持液，放入37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日在顯微鏡下觀察細胞情況，當細胞病變達“+++”時，加入5 mg/mL的MTT，每孔100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，當黃色的MTT被活細胞的線粒體脫氫酶還原成藍色的甲簪結(jié)晶，小心吸出MTT，加二甲基亞砜，每孔100 μL，震蕩混勻，10 min后于酶聯(lián)免疫檢測儀570 nm處測量各孔的吸光值(OD值)，OD值與活細胞的數(shù)量呈正相關(guān)[8-9]。

1.2.5 藥物直接抗病毒 將生長良好的Hep-2細胞經(jīng)胰酶消化后，稀釋成濃度為104/mL的細胞懸液，接種于96孔板中，24 h后用2%細胞維持液將K-CoxB-JN復(fù)方新制劑及利巴韋林顆粒從藥物TD0起始稀釋4個濃度(原液、1∶2、1∶4、1∶8)，將含有不同濃度的藥物各100 μL和CVB3病毒液100 μL混合，放入37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 h后倒掉96孔板中的細胞培養(yǎng)液，將藥物和病毒混合的培養(yǎng)液加入到96孔板中，每孔200 μL，正常對照組加2%細胞維持液，每孔200 μL，病毒對照組加入100 TCID50的CVB3病毒液，每孔200 μL，放入37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日在顯微鏡下觀察細胞情況，當細胞病變達“+++”時做MTT，方法同1.2.4。

1.2.6 藥物對病毒釋放的影響 將Hep-2細胞配制成濃度為104/mL的細胞懸液，加入96孔培養(yǎng)板中，24 h后加入100 TCID50的CVB3病毒液，每孔100 μL。另設(shè)正常對照組和病毒對照組，放入37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 h后加入從藥物TD0起始稀釋4個濃度(原液、1∶2、1∶4、1∶8)的含K-CoxB-JN復(fù)方新制劑和利巴韋林顆粒的生長液，每孔100 μL，每個濃度設(shè)4個復(fù)孔，正常對照組和病毒對照組加100 μL含2%胎牛血清的細胞維持液，放入37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日在顯微鏡下觀察細胞情況，當細胞病變達“+++”時做MTT，方法同1.2.4。

2 結(jié) 果

2.1 K-CoxB-JN復(fù)方新制劑及利巴韋林顆粒不同濃度對細胞的保護作用 見表1。

表1 K-CoxB-JN復(fù)方新制劑及利巴韋林顆粒不同濃度對細胞的保護作用

由表1可見，不同濃度的K-CoxB-JN復(fù)方新制劑組及利巴韋林顆粒組OD值均高于病毒對照組(P<0.05)，但低于正常對照組(P<0.05)。說明K-CoxB-JN復(fù)方新制劑及利巴韋林顆粒藥物能保護細胞，當K-CoxB-JN復(fù)方新制劑濃度為0.781 25 mg/mL、利巴韋林顆粒濃度為3.125 mg/mL時對細胞的保護作用最明顯。2.2 K-CoxB-JN復(fù)方新制劑及利巴韋林顆粒不同濃度的抗病毒作用 見表2。

表2 K-CoxB-JN復(fù)方新制劑及利巴韋林顆粒不同濃度的抗病毒作用

由表2可見，不同濃度的K-CoxB-JN復(fù)方新制劑組及利巴韋林顆粒組OD值均高于病毒對照組(P<0.05)，但低于正常對照組(P<0.05)。說明不同濃度的K-CoxB-JN復(fù)方新制劑及利巴韋林顆粒均有明顯的抗病毒作用，且隨著藥物濃度的增加，細胞存活率逐漸升高，表現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。

2.3 K-CoxB-JN復(fù)方新制劑及利巴韋林顆粒不同濃度對病毒釋放的影響 見表3。

表3 K-CoxB-JN復(fù)方新制劑及利巴韋林顆粒不同濃度對病毒釋放的影響

由表3可見，不同濃度的K-CoxB-JN復(fù)方新制劑組及利巴韋林顆粒組OD值均高于病毒對照組(P<0.05)，但低于正常對照組(P<0.05)。

2.4 K-CoxB-JN復(fù)方新制劑及利巴韋林顆粒不同濃度對細胞的毒性作用 見表4。

表4 K-CoxB-JN復(fù)方新制劑與利巴韋林顆粒不同劑量對細胞的毒性作用

由表4可見，多次實驗發(fā)現(xiàn)藥物對Hep-2毒性表現(xiàn)為細胞增殖緩慢，折光性差，邊界模糊，但未見脫落壞死，48 h后觀察細胞病變反應(yīng)，測得K-CoxB-JN復(fù)方新制劑TC0為1.562 5 mg/mL，利巴韋林顆粒TC0為6.25 mg/mL。

說明不同濃度的K-CoxB-JN復(fù)方新制劑及利巴韋林顆粒均能抑制病毒的釋放，且抑制病毒釋放作用隨著藥物濃度的增加而增加，表現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。

3 討 論

病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是由各種病毒感染引起的急、慢性心肌炎癥反應(yīng)，很多病毒都可能引起心肌炎，其中CVB3是引起VMC的主要病原體之一[10]。MTT法又稱MTT比色法，其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲簪并沉積在細胞中，而死細胞無此功能，該法已被應(yīng)用于細胞系的體外抗癌藥物篩選及腫瘤臨床的化療藥敏測定[11]。利巴韋林屬于人工合成核苷，具有廣譜抗RNA和DNA病毒的作用，能抑制病毒的復(fù)制[12]，治療VMC有較好療效[13]。本實驗通過不同的加藥和加病毒方式，用MTT法檢測CVB3感染的Hep-2細胞的活性，觀察K-CoxB-JN復(fù)方新制劑對CVB3感染的Hep-2細胞的影響。結(jié)果表明，當K-CoxB-JN復(fù)方新制劑濃度為0.781 25 mg/mL、利巴韋林濃度為3.125 mg/ml時對CVB3感染的Hep-2細胞保護作用最明顯；當K-CoxB-JN復(fù)方新制劑濃度為1.562 5 mg/mL、利巴韋林濃度為6.25 mg/mL時直接抗病毒和抑制病毒釋放作用最明顯，并且表現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。不同濃度的K-CoxB-JN復(fù)方新制劑對CVB3感染的Hep-2細胞具有保護作用，能直接抗CVB3病毒，并且能抑制病毒的釋放，本實驗結(jié)果為進一步進行K-CoxB-JN復(fù)方新制劑的體內(nèi)外實驗提供了研究依據(jù)。

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