王小闖，李滿祥，黨曉燕，李 萍，彭 卓，高彥霞，古長維，姚 洋(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬

肺動脈高壓(pulmonary artery hypertension，PAH)，特別是繼發(fā)于慢性呼吸系統(tǒng)疾病的繼發(fā)性肺動脈高壓，是常見的臨床綜合征［1］。未經(jīng)治療的肺動脈高壓多數(shù)死于肺源性心臟病右心衰竭［2］。由于導(dǎo)致繼發(fā)性肺動脈高壓的原發(fā)性呼吸系統(tǒng)疾病具有反復(fù)發(fā)作或者難以根治的特點，因此預(yù)防及治療肺動脈高壓有著十分重要的臨床意義。不論是原發(fā)性或繼發(fā)性肺動脈高壓，其發(fā)生、發(fā)展有著共同的分子機制，即肺血管的緊張性增高和肺動脈壁的結(jié)構(gòu)性重塑?，F(xiàn)普遍認為肺血管平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)的增殖、侵襲和凋亡在PAH發(fā)生中起著關(guān)鍵性的作用［3，4］。

鈣離子是細胞內(nèi)的第二信使，它調(diào)節(jié)細胞的多種生物學(xué)行為，如細胞增殖和細胞周期。作為鈣離子進入細胞內(nèi)的主要門戶，鈣離子通道在調(diào)節(jié)細胞增殖和細胞周期方面的作用逐漸被人們認識。瞬時受體電勢通道是一類離子通道，可通透鈣離子，起初在果蠅中被發(fā)現(xiàn);突變體果蠅的視覺受體對持續(xù)性光刺激僅表現(xiàn)出瞬時的受體電勢，所以鈣通道由此而得名［5］。經(jīng)典型瞬時受體電位6(transient receptor potential canonical 6，TRPC6)即為其中之一，它廣泛表達于多種組織［6－8］。研究表明，在原發(fā)性及繼發(fā)性肺動脈高壓患者或動物模型中，肺血管平滑肌細胞膜TRPC6的表達明顯升高［9］。但目前尚未有文獻報道TRPC6對RPASMCs的生物學(xué)功能的影響。因此，本研究以RPASMCs為對象，構(gòu)建TRPC6的siRNA以及過表達載體，轉(zhuǎn)入細胞后采用MTT、Transwell小室實驗和流式細胞儀等方法研究TRPC6對RPASMCs增殖、遷移和凋亡的影響，擬探討TRPC6在PAH病變中的作用，為肺動脈高壓的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料

CO2細胞培養(yǎng)箱(Binder，德國);酶聯(lián)免疫檢測儀(Sheldon，美國);流式細胞儀(Olympus，日本);RNAiso plus kit、PrimeScript?RT reagent kit、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ kit，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ，T4 連接酶;載體 pMD19-T、pcDNA3(Takara，中國)，LipofectamineTMRNAiMAX(Invitrogen，美國);Bio-Rad iQ5實時定量PCR儀、激光共聚焦顯微鏡(Bio-Rad，美國);BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、抗β-肌動蛋白抗體、抗TRPC6抗體、辣根過氧化物酶標記羊抗兔 IgG(Abcam，美國);M254 培養(yǎng)基、MTT、DMSO、TBST 緩沖液、胎牛血清(FCS)、碘化吡啶(GIBCO BRL，美國)。

1.2 大鼠PASMCs的分離與培養(yǎng)

雄性SD大鼠經(jīng)戊巴比妥麻醉后剖胸，右心室注入500 U肝素，整體取出心、肺置于平皿中，以無鈣Hanks液清洗3遍。顯微鏡下自肺動脈主干逐級追入肺實質(zhì)，取3級以下分支，無鈣Hanks液清洗3遍。于37℃ CO2培養(yǎng)箱中消化90 min。經(jīng)消化的細胞加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液配成1×105/ml的細胞懸液，倒置于CO2孵箱中3 h，待組織塊貼壁牢固后，翻正培養(yǎng)瓶使組織塊完全浸泡在培養(yǎng)液中，放入CO2孵箱繼續(xù)培養(yǎng)4 d后，于倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。待原代細胞生長至匯合狀態(tài)、鋪滿瓶壁的80%以上時，進行傳代。實驗用4－7代平滑肌細胞。

1.3 真核表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染

以實驗室保存的TRPC6序列為模板，以TRPC6引物擴增TRPC6目的片段，其上游引物序列5’－AAGACACTGTTCTATATT－3’，下游引物序列5’－TGCACCAGATTGAAGGGA ACAGG－3’。將目的片段與pMD19－T載體在16℃條件下進行連接反應(yīng)，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于感受態(tài)大腸桿菌DH5α，培養(yǎng)后進行篩選，挑選陽性菌落搖菌并提取質(zhì)粒，電泳鑒定后獲得重組質(zhì)粒pMD19T-TRPC6。以重組質(zhì)粒為模板，擴增TRPC6編碼區(qū)序列，擴增產(chǎn)物以EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切，并用T4DNA連接酶將其與經(jīng)相同酶切的真核表達載體pcDNA3連接，篩選獲得重組表達載體pcDNA3-TRPC6。

TRPC6-siRNA由上海生工合成，其上游引物序列5’－GACCUAGCAGAACUUAUUA－3’，下游引物序列 5’－UAAUAAGUUCUGCUAGGUC－3’;對照為 TRPC6非特異 siRNA，上游引物序列5’－UUCCCCGAACGU GUCACG U－3’，下游引物序列5’－ACGUGACACGUUCGGAGAA－3’。實驗組加入TRPC6-siRNA混合物或重組表達載體pcDNA3-TRPC6，同時設(shè)置空白對照組(control)和脂質(zhì)體對照組(mock)。按5×104/孔密度接種RPASMCs至24孔培養(yǎng)板中，待其長至60%融合時，采用LipofetamineTM2000將TRPC6-siRNA或重組表達載體pcDNA3-TRPC6轉(zhuǎn)染細胞。24 h后采用 Western blot檢測各組的轉(zhuǎn)染效率。

1.4 Western blot檢測

收集各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞，用組織蛋白裂解液提取各組細胞的總蛋白，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。取40 μg總蛋白進行常規(guī)SDS-PAGE電泳。經(jīng)電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，10%脫脂奶粉4℃封閉PVDF膜過夜，加10%脫脂奶粉稀釋的一抗加于膜上，室溫反應(yīng)60 min;用 TBST緩沖液(0.05 mol/L Tris，0.15 mol/L NaCl，0.05%Tween 20)洗膜10 min ×3次;加二抗37℃孵育45 min，TBST緩沖液洗膜10 min×3次，滴加ECL試劑，將PVDF膜放入X線片暗盒，在暗室中壓片，顯影。以β-actin作為內(nèi)參。

1.5 RNA的提取與實時定量RT-PCR

采用RNAiso plus kit試劑盒提取細胞中的總RNA，按照試劑盒要求操作。TRPC6上游引物5’－CACCGGCGGCAGACAGTTCTTCG－3’，下游引物序列5’－CTTGCTGGAGTTCAGACTGGCTGG G－3’。β-actin上游引物序列5’－GGTGTGATGGTGGGTATGGGT－3’，下游引物序列 5’－CTGGGTCATCTTTTCACGGT－3’。按照試劑盒的說明書進行RT-PCR。擴增條件為:預(yù)變性94℃ 5 min，進入循環(huán)，變性94℃ 1 min，退火60℃ 1 min，延伸72℃3 min，30 個循環(huán)后，72 ℃延伸5 min。依據(jù)2－ΔΔCt法計算control組、mock組、TRPC6-overexpression組及TRPC6-siRNA組細胞TRPC6 mRNA的相對表達量。

1.6 MTT法測定RPASMCs增殖

分別取對數(shù)生長期RPASMCs接種于96孔培養(yǎng)板，每孔1 ×104，共 100 μl，每組 3 孔，置于 37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)48 h。0.25%胰酶消化control組、mock組、TRPC6-overexpression組及 TRPC6-siRNA組細胞，吸去胰酶，加入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)60 min。每孔加入 MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，繼續(xù)孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μl DMSO，振蕩10 min后進行比色測定，酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長讀取OD值。

1.7 Transwell法檢測細胞侵襲能力

將培養(yǎng)的RPASMCs消化成單細胞懸液，無血清培養(yǎng)基洗3次，將細胞懸液密度調(diào)整成2×105/ml備用。預(yù)先將Matrigel用無血清培養(yǎng)基DMEM稀釋成1∶3濃度，均勻地鋪滿Transwell小室上室的聚碳酸酯膜，室溫放置1 h，使Matrigel凝固形成基質(zhì)膜。Transwell下腔小室加入500 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，小室內(nèi)接種200 μl無血清細胞懸液，培養(yǎng)20 h后取出Transwell膜，預(yù)冷的PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡下拍照，統(tǒng)計穿過Transwell膜的細胞數(shù)。

1.8 流式細胞儀檢測細胞凋亡

用預(yù)冷的PBS洗滌PASMCs 3次，加入1 ml 1×AnnexinⅤ結(jié)合緩沖液，離心去上清，再加入200 μl結(jié)合緩沖液重懸細胞，分別加入10 μl AnnexinⅤ-FITC 和 5 μl PI(5 μg/ml)，輕輕混勻，室溫避光孵育20 min，進行流式細胞儀檢測。

1.9 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率的測定

提取轉(zhuǎn)染后各組細胞總RNA和蛋白，采用RTPCR和Western blot檢測TRPC6 mRNA和蛋白的表達。RT-PCR結(jié)果顯示，脂質(zhì)體對照組(mock組)RPASMCs中TRPC6 mRNA表達水平較對照組無明顯變化(見圖1)，而TRPC6過表達組RPASMCs中TRPC6 mRNA 表達水平為1.48 ±0.12，TRPC6-siRNA組RPASMCs中 TRPC6 mRNA表達水平為0.65±0.04，與對照組相比均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，moc組RPASMCs中TRPC6蛋白表達水平幾乎無變化(見圖2)，而TRPC6過表達組TRPC6蛋白表達水平明顯上調(diào)，TRPC6-siRNA組TRPC6蛋白表達水平明顯降低。

圖1 各組TRPC6 mRNA表達的RT-PCR結(jié)果Figure 1 The TRPC6 mRNA expression in four goups by RT-PCR

圖2 各組TRPC6蛋白表達的Western blot結(jié)果Figure 2 Western blot results of TRPC6 protein expression in four groups

2.2 TRPC6促進RPASMCs的增殖

通過MTT法測定各組反應(yīng)細胞數(shù)的OD值，結(jié)果顯示，與對照組相比，mock組無顯著變化;而TRPC6過表達組可以促進RPASMCs的增殖，其OD值為1.13 ±0.09，TRPC6-siRNA 組則可抑制 RPASMCs的增殖，其OD值為0.42±0.03，兩組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05，見圖3)。

圖3 TRPC6對RPASMCs增殖的影響Figure 3 The effect of TRPC6 on RPASMCs proliferation

2.3 TRPC6促進RPASMCs的侵襲

與對照組相比，mock組無顯著變化;而TRPC6過表達組可以促進RPASMCs的侵襲，穿膜細胞數(shù)相應(yīng)地增加，其值為108 ±7(P＜0.05，見圖4)，TRPC6-siRNA組則可抑制RPASMCs的侵襲，穿膜細胞數(shù)相應(yīng)地減少，其值為38±3，兩組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。

圖4 TRPC6對RPASMCs侵襲的影響Figure 4 Effect of TRPC6 on RPASMCs invasion

2.4 TRPC6對RPASMCs凋亡的影響

采用流式細胞儀檢測AnnexinⅤ/PI熒光強度，細胞凋亡圖的左下象限為活細胞，左上象限為壞死細胞，右下象限為早期凋亡細胞，右上象限為晚期凋亡細胞，將右下象限和右上象限之和記為細胞總凋亡率。與對照組相比，各實驗組的總細胞凋亡率均無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05，見圖5)。

圖5 TRPC6對RPASMCs凋亡的影響Figure 5 Effect of TRPC6 on RPASMCs apoptosis

3 討論

PAH是一種嚴重威脅人類健康的臨床癥狀，其病理過程主要有:肺小動脈閉塞及有效循環(huán)血管床數(shù)量的銳減，肺血管內(nèi)皮細胞損傷引起血管收縮反應(yīng)增強和PASMCs增生、侵襲，外周小血管肌化以及細胞外基質(zhì)的增多，導(dǎo)致肺血管重塑［10］。其中，PASMCs的增殖和侵襲是肺血管重塑形成的主要因素。

通過本實驗的研究，我們發(fā)現(xiàn)TRPC6過表達載體轉(zhuǎn)染RPAMSCs后，RPAMSCs中TRPC6 mRNA及蛋白表達水平均上升，同時可促進RPAMSCs的增殖和侵襲;而 TRPC6-siRNA轉(zhuǎn)染 RPAMSCs后，RPAMSCs中TRPC6 mRNA及蛋白表達水平均下降，同時可抑制RPAMSCs的增殖和侵襲。此外，流式細胞儀結(jié)果表明TRPC6對細胞凋亡并沒有顯著影響。綜上所述，TRPC6可促進RPASMCs的增殖和侵襲，在PAH的發(fā)生中起著重要作用。

PASMCs增殖和凋亡失衡是肺動脈高壓形成的主要原因。正常情況下，凋亡與增殖這兩個對立面相互制約，共同維持著組織器官結(jié)構(gòu)的相對穩(wěn)定，一旦這種平衡在各種內(nèi)因、外因的影響下被打破，將導(dǎo)致組織臟器萎縮、增生或構(gòu)型重建等病理狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)TRPC6可促進RPASMCs的增殖，而對細胞的凋亡基本無影響。這表明TRPC6影響PAH的發(fā)生主要通過調(diào)控RPASMCs的增殖和侵襲來實現(xiàn)。

文獻報道，用血管緊張素Ⅱ刺激血管平滑肌細胞(VSMC)建立大鼠的VSMC增殖模型，采用MTT法檢測不同濃度的TRPC6通道阻斷劑和激動劑對VSMC的影響，研究發(fā)現(xiàn)，不同劑量阻斷劑阻斷TRPC6通道后，經(jīng)過72 h的作用均可抑制介導(dǎo)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的VSMC的增殖，且呈劑量依賴性;用不同劑量TRPC6激動劑激活TRPC6通道，經(jīng)過24 h的作用均可促進介導(dǎo)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的VSMC的增殖，并且呈劑量依賴性［11］。本研究結(jié)果也表明了TRPC6可促進 RPASMCs的增殖，提示 TRPC6在PAH的發(fā)生和發(fā)展中可能發(fā)揮著重要作用。此外，由于TRPC6還能夠促進RPASMCs的侵襲，有望成為PAH治療的潛在靶分子。雖然本研究證實了TRPC6在PAH中發(fā)揮著重要作用，但確切的信號途徑尚不清楚，有待于進一步研究。

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