駱禮波，程家平，楊偉明，石 磊，賀新媛，楊雪峰，劉 勤，蘇曉玥，任 宇 (.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，貴州 遵義 563003;.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸外科，貴州 遵義 563003)

大腸癌是常見(jiàn)消化道惡性腫瘤，影響患者預(yù)后是腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。早在1971年，F(xiàn)olkman等［1］就提出“腫瘤血管生長(zhǎng)因子理論”，他們認(rèn)為:腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移依賴(lài)于新生血管生成。在促進(jìn)腫瘤血管生長(zhǎng)諸多因子中，有VEGF家族，F(xiàn)GF家族及PDGF家族等，PDGF家族是研究相對(duì)較早因子之一。早在1973年，Ross［2］在人血清中發(fā)現(xiàn)了PDGF，其分子量為27～31 KD，為由A、B兩鏈組成的堿性蛋白質(zhì)，因來(lái)源血小板而得名。PDGF家族成員包括PDGF－A，PDGF－B，PDGF－C，PDGF－D。多項(xiàng)研究表明，PDGF－A是該家族中研究最多，相對(duì)較成熟的腫瘤新生血管誘發(fā)因子。Sharma等［3］指出MVD最有價(jià)值的是能預(yù)測(cè)實(shí)體腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，并與實(shí)體腫瘤各種預(yù)后因素有關(guān)，是預(yù)測(cè)全身和局部復(fù)發(fā)及無(wú)病生存的重要指標(biāo)。Katano等［4］報(bào)道:PDGF－A與胃癌關(guān)系密切，可能在胃癌預(yù)后中起重要作用。越來(lái)越多研究表明，PDGFA在多種腫瘤中過(guò)度表達(dá)，與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)［5］，參與成纖維細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等增殖，具有趨化性和促有絲分裂性能，可以促進(jìn)結(jié)締組織并產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(ECM)及直接或間接導(dǎo)致腫瘤血管生成。閆巍中等［6］研究報(bào)道:血管生成素(angiogenin)中的促血管生成素－1(Ang－1)，促血管生成素－2(Ang－2)及促血管生成素受體－2(Tie－2)表達(dá)程度與大腸癌的進(jìn)展期呈正相關(guān)，而運(yùn)用PDGF－A和MVD對(duì)大腸癌患者生存期進(jìn)行評(píng)估，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)鮮于報(bào)道。本研究運(yùn)用免疫組化方法(Envision法)探討PDGF－A和MVD在大腸癌組織中表達(dá)與患者生存預(yù)后關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料:收集我院胃腸外科1997年3月～2007年2月生存期≥5年(甲組)及≤3年(乙組)大腸癌患者組織標(biāo)本各30例。所有標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)為大腸癌組織，全部患者均為第一次手術(shù)，術(shù)前均未接受任何放療、化療和其他治療。甲組:男14例，女16例;年齡30～79歲，平均50.1歲。Dukes分期，A+B期18例，C+D期14例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者19例。乙組:男18例，女12例;年齡27～73歲，平均56.1歲;Dukes分期，A+B期12例，C+D期16例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者14例。60例中，29例未突破肌層，其余31例全部浸潤(rùn)至漿膜及漿膜層外。分化程度方面，高分化腺癌28例、中低分化腺癌及黏液腺癌32例。

1.2 免疫組化試劑，儀器及其他耗材:特異性一抗是兔抗人PDGF－A多克隆抗體(編號(hào)bs－0196R，工作液濃度1:100)，購(gòu)于北京博奧森公司;鼠抗人CD34單克隆抗體(工作液濃度1:100)購(gòu)于福州邁新公司。二抗試劑盒(編號(hào)GK500705，包括Envision二抗檢測(cè)即用型，DAB顯色試劑)購(gòu)于美國(guó)基因公司。經(jīng)多聚賴(lài)氨酸處理的防脫玻片，PBS緩沖液，EDTA抗原修復(fù)液及一抗稀釋液均購(gòu)于北京中杉金橋公司。另二甲苯，乙醇，雙氧水，蘇木素，微波爐均為實(shí)驗(yàn)室自備。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組化染色:石蠟組織切割成4 μm厚切片，均經(jīng)HE染色再次確認(rèn)原始組織學(xué)診斷后行免疫組化染色。二甲苯梯度脫蠟兩次，每次10 min，乙醇梯度水化，3%雙氧水浸泡10 min去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，EDTA微波修復(fù)抗原(CD34，PDGF－A均為10 min)，自然冷卻后PBS液沖洗3次，每次5分鐘，加一抗后4℃過(guò)夜。第二次給予PBS液沖洗3次，每次5分鐘。滴加二抗，室溫30 min后再次PBS液沖洗3次，每次5分鐘。DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，乙醇梯度脫水，透明，中性樹(shù)膠封片。以PDGF－A，CD34強(qiáng)陽(yáng)性片為陽(yáng)性對(duì)照，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3.2 結(jié)果判定

1.3.2.1 PDGF－A判斷:PDGF－A主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞漿或胞膜上，在癌旁的間質(zhì)中可見(jiàn)少量表達(dá)，以胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性。每張切片選取10個(gè)不同部位，400倍視野下計(jì)數(shù)，按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例和染色深度進(jìn)行評(píng)分和分級(jí)。染色強(qiáng)度分級(jí):無(wú)著色為0分，淡棕黃色為1分，棕黃色及更深顏色為2分;陽(yáng)性細(xì)胞分級(jí):陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤50%為0分，＞50% ～75%為1分，＞75%為2分。兩項(xiàng)得分相加，結(jié)果2分為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3.2.2 MVD判斷:作為標(biāo)記微血管最主要的CD34，以血管內(nèi)皮細(xì)胞胞膜染成棕黃色或棕褐色為陽(yáng)性表達(dá)，MVD計(jì)數(shù)參照Maeda等報(bào)道方法［7］，計(jì)數(shù)5個(gè)高倍鏡視野(×200)內(nèi)微血管數(shù)，取其平均數(shù)為該組織MVD值。以上免疫組化染色結(jié)果均由具備多年病理診斷經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員2人采用雙盲法參與判定。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，采用Spearman等級(jí)相關(guān)進(jìn)行相關(guān)性分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PDGF－A，MVD表達(dá)與性別，年齡，分化程度及病理分型關(guān)系:免疫組化顯示:大腸癌組織中PDGF－A主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的胞漿或胞膜內(nèi)，以胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒陽(yáng)性染色為主，而尤其以癌巢邊緣著色明顯，表明PDGF－A表達(dá)最明顯部位位于腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)前緣，見(jiàn)圖1，腫瘤組織間質(zhì)間可見(jiàn)少量表達(dá)。CD34是目前運(yùn)用最多，較為成熟的標(biāo)記微血管蛋白，以血管內(nèi)皮細(xì)胞胞膜染成棕黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。主要表達(dá)于腫瘤間質(zhì)區(qū)，微血管數(shù)量以腫瘤周邊相對(duì)較多，見(jiàn)圖 2。60例中，PDGF－A陽(yáng)性表達(dá)率為53.3%(32/60)，MVD值為20～76，平均為41.05。兩者與性別、年齡、TNM分期、浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)。見(jiàn)表1。

圖1 A大腸癌癌巢胞質(zhì)內(nèi)PDGF－A的表達(dá)(×400)

表1 大腸癌組織中PDGF－A.MVD的表達(dá)與臨床病理參數(shù)關(guān)系

圖2 A大腸癌癌巢間質(zhì)內(nèi)CD34的表達(dá)(×100)B大腸癌癌巢邊緣上CD34的表達(dá)(×400)

2.2 PDGF－A，MVD表達(dá)與病理學(xué)分級(jí)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間關(guān)系:PDGF－A，MVD在腫瘤細(xì)胞病理學(xué)分級(jí)的中低分化型，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的表達(dá)分別為65.6%(21/32)，70.4%(19/27);(45.72±11.87)，(44.37±12.50)均顯著高于高分化型，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的 39.3%(11/28)，39.4%(13/33);(35.71±9.37)，(38.33±10.65)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 PDGF－A，MVD表達(dá)與生存期，患者預(yù)后關(guān)系:生存期≥5年大腸癌患者(甲組)與≤3年大腸癌患者(乙組)PDGFA，MVD表達(dá)分別為36.7%(11/30)，70.0%(21/30);(37.70±10.32)，(44.40±12.42)。差異較為顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。研究發(fā)現(xiàn)，PDGF－A著色及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表達(dá)越多切片，相對(duì)應(yīng) MVD值越高。兩者呈正相關(guān)(r=0.965，P＜0.05)。

3 討論

Folkman指出:血管形成可根據(jù)腫瘤發(fā)展分為血管前期和血管期。在血管前期，實(shí)體瘤緩慢生長(zhǎng)或不生長(zhǎng)，多數(shù)直徑不超過(guò)1mm，很少向周?chē)?rùn)，幾乎不發(fā)生轉(zhuǎn)移［8］。一旦進(jìn)入血管期，腫瘤必須要建立自身的血管系統(tǒng)以獲得充足的氧和營(yíng)養(yǎng)成分，生長(zhǎng)速度隨之加快，瘤體向周?chē)忠u。由于新生腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞不完整或基底膜中斷、缺如、脫落，腫瘤細(xì)胞容易進(jìn)入血液循環(huán)，引起腫瘤侵襲，轉(zhuǎn)移?？梢哉f(shuō)，腫瘤血管的新生在腫瘤良惡性間，惡性腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間扮演了極其重要的角色。多項(xiàng)研究顯示，血管的新生需要多種誘發(fā)因子，如細(xì)胞因子，生長(zhǎng)因子，ECM復(fù)合物等［9］。在這些血管生長(zhǎng)因子中，PDGF與VEGF，F(xiàn)GF有相似的促血管生成作用。MVD是腫瘤微血管形成程度的標(biāo)志和腫瘤的生物學(xué)特征，是評(píng)價(jià)腫瘤血管生成狀態(tài)的最佳指標(biāo)。已有多項(xiàng)研究表明，在乳腺癌、腎癌、頭頸部腫瘤等的MVD高低與腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

PDGF促進(jìn)血管生成的機(jī)制可能為:①腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞都表達(dá)PDGF受體，因此，PDGF在腫瘤表達(dá)上可起自分泌或旁分泌作用。②通過(guò)間接途徑即激活鄰近組織細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞釋放VEGF，F(xiàn)GF等生長(zhǎng)因子促進(jìn)血管生成。③參與并促進(jìn)惡性腫瘤間質(zhì)反應(yīng)，PDGF與其受體結(jié)合可提高ECM降解及促進(jìn)腫瘤侵襲，轉(zhuǎn)移過(guò)程。在腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本試驗(yàn)表明，生存期≥5年大腸癌患者在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，其PDGF－A陽(yáng)性率，MVD數(shù)值與≤3年大腸癌患者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PDGF－A對(duì)大腸癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移可能有促進(jìn)作用，PDGF－A和MVD可以作為判斷大腸癌患者預(yù)后的重要參考指標(biāo)。但其病理學(xué)分級(jí)間的顯著差異與辛林等［10］報(bào)道PDGF－A與病理學(xué)分級(jí)無(wú)關(guān)，而與Dukes分期呈正相關(guān)不相符合。PDGF－A與病理學(xué)分級(jí)相關(guān)原因不清楚，國(guó)內(nèi)曾有在口腔鱗狀細(xì)胞癌中PDGF－A與病理學(xué)分級(jí)有密切聯(lián)系的報(bào)道。關(guān)于在大腸癌中這兩者之間關(guān)系報(bào)道甚少，需要深入探討研究。

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