高 侃 魏 東 耿 惠 劉敏彥

(河北省辛集市第二醫(yī)院放化療科，河北 辛集 052360)

碎巖散是河北省辛集市第二醫(yī)院自主研發(fā)的中藥復(fù)方制劑，由黃芪、炮附子、肉桂、鹿角膠、熟地黃等組成，用于治療氣虛陽(yáng)微型中晚期食管癌。黃芪為君藥，具有補(bǔ)氣固表、利尿排毒、斂瘡生肌的功效[1]，主要含有皂苷、黃酮、多糖、氨基酸和多種微量元素[2]，其中黃芪甲苷為主要活性指標(biāo)成分之一。為有效控制其質(zhì)量，我們采用高效液相色譜法-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(HPLC-ELSD)測(cè)定碎巖散中黃芪甲苷的含量，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1 儀器 高效液相色譜儀(Agilent 1100，美國(guó)Agilent公司)，配有HPLC泵(Agilent G1311A Quat Pump)，自動(dòng)進(jìn)樣器(Agilent G1313A ALS)；柱溫箱(Agilent G1316A Colcom)；脫氣機(jī)(Agilent G1379A Degasser)；Alltech-2000型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(Evaporative Light Scattering Detector，ELSD)。

1.1.2 試藥 黃芪甲苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)；碎巖散(河北省辛集市第二醫(yī)院，批號(hào)110501)；甲醇為色譜純(美國(guó)Fisher公司)，水為雙蒸餾水，三氯甲烷、正丁醇、氫氧化鈉均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 溶液制備

1.2.1.1 供試品溶液制備 取碎巖散約4 g，精密稱(chēng)定，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲提取30 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25 mL，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)盟?0 mL定量轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用三氯甲烷萃取2次，每次20 mL，棄去三氯甲烷液，水層用水飽和的正丁醇提取4次(20 mL/次)，合并正丁醇液，用0.1% 氫氧化鈉(NaOH)溶液洗滌2次(10 mL/次)，再用正丁醇飽和的水洗滌2次(10 mL/次)，合并堿洗液和水洗液，用水飽和的正丁醇提取2次(10 mL/次)，與上述正丁醇液合并，置水浴上蒸干，殘?jiān)?5%甲醇定量轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

1.2.1.2 黃芪甲苷對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取黃芪甲苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每mL約含黃芪甲苷0.1 mg的溶液，即得。

1.2.2 色譜條件 色譜柱為 Agilent HC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-水(75∶25)，流速為0.8 mL/min，ELSD檢測(cè)漂移管溫度為100 ℃，氣體流速為3 L/min，分別精密吸取黃芪甲苷對(duì)照品溶液10、20 μL與供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，用ELSD測(cè)定，以外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程計(jì)算黃芪甲苷含量即得。理論塔板數(shù)按黃芪甲苷峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000。

1.2.3 線性關(guān)系考察 精密吸取黃芪甲苷對(duì)照品溶液(98.18 μg/mL)5、10、20、30、50 μL注入高效液相色譜儀中，進(jìn)行測(cè)定。以進(jìn)樣量的自然對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取黃芪甲苷對(duì)照品溶液10 μL，分別連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，測(cè)定相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，每隔4 h進(jìn)樣1次，進(jìn)樣量10 μL，測(cè)定峰面積。

1.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批碎巖散，分別稱(chēng)取高(5 g)、中(4 g)、低(3 g)3個(gè)劑量，每個(gè)劑量3份，按照1.2.1.1項(xiàng)下制備方法，分別進(jìn)行超聲提取，制備，注入高效液相色譜儀測(cè)定。

1.2.7 陰性試驗(yàn) 按照碎巖散的制備方法制成不含黃芪的模擬制劑，按照1.2.1.1項(xiàng)目制備方法制成陰性對(duì)照品溶液，按含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 采用加樣回收實(shí)驗(yàn)，取同一批碎巖散9份，分別加入低、中、高3個(gè)濃度的黃芪甲苷對(duì)照品溶液50 mL，按照1.2.1.1項(xiàng)下制備方法，進(jìn)行提取，制備，測(cè)定，計(jì)算回收率。

1.2.9 耐用性試驗(yàn) 對(duì)不同的色譜柱、不同的柱溫和漂移管溫度變化時(shí)對(duì)黃芪甲苷含量的影響進(jìn)行考察。

2 結(jié) 果

2.1 線性關(guān)系考察 黃芪甲苷在5～50 μL (即0.490 9～4.909 μg)范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，其進(jìn)樣量的自然對(duì)數(shù)與峰面積積分值的自然對(duì)數(shù)回歸方程為：Lny=1.712 Lnx+7.106，r=0.9 998。

2.2 精密度試驗(yàn) 黃芪甲苷RSD為2.19%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 在測(cè)定的24 h內(nèi)，黃芪甲苷RSD為2.23%，說(shuō)明溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 黃芪甲苷RSD為1.67%，說(shuō)明方法的重現(xiàn)性良好。

2.5 陰性試驗(yàn) 其他組分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，見(jiàn)圖1、2、3。

圖1 黃芪甲苷對(duì)照品色譜圖

圖2 陰性對(duì)照品色譜圖

圖3 碎巖散色譜圖

2.6 加樣回收率試驗(yàn) 黃芪甲苷的平均回收率為99.54%(n=9)，RSD為1.93%，說(shuō)明方法準(zhǔn)確度良好，見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率結(jié)果

2.7 耐用性試驗(yàn) 更換不同的色譜柱(Diamonsil C18，4.6 mm×250 mm，5 μm；Agilent Zorbax XDB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm；Phenomenon Gemini C18，4.6 mm×250 mm，5 μm)測(cè)定同一份供試品溶液中黃芪甲苷含量的RSD為2.53%；柱溫發(fā)生變化(25 ℃、30 ℃、35 ℃)，測(cè)定同一份供試品溶液中黃芪甲苷含量的RSD為2.05%；漂移管溫度發(fā)生變化(75 ℃、80 ℃、85 ℃)，測(cè)定同一份供試品溶液中黃芪甲苷含量的RSD為2.22%。

3 討 論

供試品的處理采用了甲醇超聲提取、正丁醇萃取的方法，操作簡(jiǎn)便，為減少其他成分的干擾，采用堿水對(duì)正丁醇萃取液進(jìn)行了處理，所得供試品圖譜清晰。

黃芪甲苷為末端紫外吸收物質(zhì)，采用紫外檢測(cè)器200 nm左右的檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定時(shí)，雜質(zhì)對(duì)色譜峰的干擾較大，基線不平穩(wěn)。而ELSD為通用型質(zhì)量檢測(cè)器，適合于無(wú)紫外吸收的皂苷類(lèi)化合物的檢測(cè)。ELSD的響應(yīng)值的大小由被測(cè)化合物顆粒的數(shù)量和大小決定，而不受流動(dòng)相溶劑的干擾，溶劑在漂移管中全部蒸發(fā)。該方法靈敏度高，回收率及重現(xiàn)性均較好，且空白無(wú)干擾，適用于碎巖散中黃芪甲苷的含量測(cè)定。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2010年版：一部[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：283-284.

[2] 江燕，晁若冰.黃芪藥材中黃芪甲苷和總皂苷含量的比較[J].華西藥學(xué)雜志，2007，22(3)：322-324.