常青山，宮航宇(大連市第六人民醫(yī)院綜合內(nèi)科，遼寧大連 116031)

現(xiàn)階段多項(xiàng)研究表明乙肝后肝硬化患者肝細(xì)胞損傷是由宿主免疫損傷和乙型肝炎病毒(HBV)共同作用的結(jié)果，其中在肝細(xì)胞損害中起主要作用的是細(xì)胞免疫，而T細(xì)胞又在其中發(fā)揮了主要作用，T細(xì)胞活性的降低以及亞群的紊亂可能是導(dǎo)致人體HBV不能清除、肝細(xì)胞損傷及發(fā)生慢性化的主要原因，如何糾正這種免疫失衡已成為當(dāng)前世界的一道難題。研究表明，核仁形成區(qū)嗜銀蛋白(AgNORs)的變化是核糖體DNA(rDNA)、核糖體RNA(rRNA)活性變化的標(biāo)志之一，進(jìn)而可在一定程度上反映T淋巴細(xì)胞活性的變化。本文通過(guò)對(duì)50例乙型病毒性肝炎后肝硬化患者替比夫定治療前后分別進(jìn)行了Child-Pugh分級(jí)計(jì)分及外周血AgNORs檢測(cè)，通過(guò)各檢查指標(biāo)的比較來(lái)探討替比夫定對(duì)肝硬化患者人體細(xì)胞免疫功能及病情進(jìn)展的影響。

1 材料

1.1 病例選擇

收集2011年1月1日—2011年8月1日就診的乙型病毒性肝炎后肝硬化住院患者50例，其中男性27例，女性23例;年齡30～62歲，平均42.2歲;肝硬化病程2～32 a。

肝硬化診斷依據(jù)2000年9月西安會(huì)議制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］。入選標(biāo)準(zhǔn):(1)患者有相符合的臨床表現(xiàn)，經(jīng)彩超、CT、胃鏡等輔助檢查綜合診斷;(2)患者血清乙型病毒性肝炎標(biāo)志物陽(yáng)性，HVB定量陽(yáng)性，并除外合并丙肝、丁肝及血吸蟲(chóng)感染、酒精性肝病等;(3)排除其他影響免疫功能的疾病:如艾滋病病毒(HIV)感染、肝癌、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等病例;(4)病情重，估計(jì)生存期＜3個(gè)月。

實(shí)驗(yàn)患者HBV標(biāo)志物陽(yáng)性病程為3～44 a，平均15.5 a，且未經(jīng)抗乙型肝炎病毒治療，近期未應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)劑治療。50例患者替比夫定治療前36例出現(xiàn)并發(fā)癥，其中腹水18例、肝性腦病10例、消化道出血8例;無(wú)并發(fā)癥14例。正常對(duì)照組40例，男性22例，女性18例，均為我院健康體檢者。

1.2 試劑

HBV-DNA定量檢測(cè)試劑盒(上海復(fù)星公司生產(chǎn));肝功能生化試劑盒(上海科華公司生產(chǎn));三色單抗試劑;銀染液(北京健爾康醫(yī)療設(shè)備有限公司生產(chǎn));固定液和配套試劑(北京健爾康醫(yī)療設(shè)備有限公司生產(chǎn));RPM-1640細(xì)胞培養(yǎng)液(北京健爾康醫(yī)療設(shè)備有限公司生產(chǎn))。

1.3 儀器

ABI 7500型實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)ABI公司生產(chǎn));KL型腫瘤免疫圖像分析系統(tǒng)(北京健爾康醫(yī)療設(shè)備有限公司生產(chǎn));OLYMPLIS AU640全自動(dòng)生化分析儀(日本OLYMPLIS光學(xué)株式會(huì)社生產(chǎn))。

2 方法

2.1 治療方法

治療組在常規(guī)治療(用維生素C、還原型谷胱甘肽做常規(guī)保肝治療)的基礎(chǔ)上口服替比夫定600 mg/d，療程6個(gè)月，治療期間未應(yīng)用其他抗病毒藥及調(diào)節(jié)免疫藥治療，出現(xiàn)并發(fā)癥(腹水、肝性腦病、消化道出血、低蛋白血癥)者給予相應(yīng)對(duì)癥治療，出院患者除替比夫定、利尿藥外不應(yīng)用其他藥物，對(duì)照組無(wú)治療。

2.2 標(biāo)本采集

分別于替比夫定治療前及治療后6個(gè)月抽取患者空腹肘部靜脈血檢測(cè)以下指標(biāo):(1)采用KL型腫瘤免疫圖像分析系統(tǒng)及配對(duì)試劑檢測(cè)外周血T細(xì)胞AgNORs。(2)采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè) HBV-DNA，嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。(3)采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清白蛋白(ALB)及總膽紅素(TBIL)。(4)采用全自動(dòng)血凝儀檢測(cè)凝血時(shí)間(PT)。(5)參照文獻(xiàn)［2］將實(shí)驗(yàn)患者肝性腦病、腹水、血清總膽紅素、血清白蛋白濃度、凝血酶原時(shí)間5個(gè)指標(biāo)的不同程度進(jìn)行計(jì)分。(6)HBV-DNA陰轉(zhuǎn)率計(jì)算公式:HBV-DNA陰轉(zhuǎn)率=治療后轉(zhuǎn)陰病例/治療總病例。(7)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:使用 SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，所得數(shù)據(jù)以表示，計(jì)量資料的組間比較采用t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 替比夫定治療乙型病毒性肝炎后肝硬化患者HBV-DNA陰轉(zhuǎn)率及肝功能Child-Push分級(jí)評(píng)分的改變

替比夫定治療6個(gè)月后48例患者HBV-DNA陰轉(zhuǎn)，2例未陰轉(zhuǎn)，陰轉(zhuǎn)率為96%。替比夫定治療6個(gè)月后與治療前比較，白蛋白水平明顯升高(P＜0.05)，總膽紅素水平明顯下降(P＜0.05)，凝血酶原時(shí)間明顯減少(P＜0.05)，Child-Push分級(jí)評(píng)分明顯升高(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 替比夫定治療前與治療6個(gè)月后患者血清ALB、TBIL、PT水平和Child-Push評(píng)分比較()Tab 1 ALB，TBIL and PT levels and Child-Push scores at 0 and 6 months of treatment with telbivudine()

表1 替比夫定治療前與治療6個(gè)月后患者血清ALB、TBIL、PT水平和Child-Push評(píng)分比較()Tab 1 ALB，TBIL and PT levels and Child-Push scores at 0 and 6 months of treatment with telbivudine()

組別 病例數(shù) ALB/(g/L)TBIL/(mmol/L) PT/s Child-Push評(píng)分/分50 30.2±6.7 58.8±22.9 15.8±3.4 9.6±2.2治療后治療前50 36.3±6.9 33.1±21.8 14.3±2.6 8.0±2.0

3.2 替比夫定治療前及治療6個(gè)月后AgNORs水平的變化

與正常對(duì)照組比較，替比夫定治療前后AgNORs均降低(P＜0.05)，與治療前比較，替比夫定治療后AgNORs明顯升高(P ＜0.05)，見(jiàn)表2。

表2 替比夫定治療前與治療6個(gè)月后患者T淋巴細(xì)胞亞群及AgNORs水平的變化()Tab 2 Change in T lymphocyte subsets and argyrophilic nucleolar organizer region protein(AgNORs)content at 0 and 6 months of treatment with telbivudine()

表2 替比夫定治療前與治療6個(gè)月后患者T淋巴細(xì)胞亞群及AgNORs水平的變化()Tab 2 Change in T lymphocyte subsets and argyrophilic nucleolar organizer region protein(AgNORs)content at 0 and 6 months of treatment with telbivudine()

AgNORs/%正常對(duì)照組組別 病例數(shù)40 7.45±0.58肝硬化組治療前 50 5.02±0.88肝硬化組治療后50 5.88±1.16

4 討論

T淋巴細(xì)胞是一種免疫活性細(xì)胞，它在細(xì)胞免疫乃至整個(gè)機(jī)體免疫系統(tǒng)中都有著重要的地位，細(xì)胞核的核仁由多個(gè)組成區(qū)(NORs)構(gòu)成，其中包含有 rDNA，并通過(guò)它轉(zhuǎn)錄合成rRNA等物質(zhì)，組成區(qū)的局部可以用銀染的方法顯示，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)該區(qū)主要成分為核仁轉(zhuǎn)錄因子(UBF)、核仁非組蛋白B23(簡(jiǎn)稱(chēng)B23)及核糖核酸聚合酶Ⅰ亞單位等非組蛋白，統(tǒng)稱(chēng)為AgNORs［3］。目前研究認(rèn)為UBF為參與調(diào)節(jié)rDNA轉(zhuǎn)錄的蛋白，而B(niǎo)23參與核糖體前RNA(pre rRNA)的轉(zhuǎn)錄、加工及裝配，而核糖核酸聚合酶Ⅰ亞單位能夠催化rRNA的合成，這些研究表明AgNORs是具有輔助轉(zhuǎn)錄活性的非組蛋白。另外細(xì)胞周期不同，AgNORs的含量也不同，在細(xì)胞處于相對(duì)靜息的時(shí)期，AgNORs的含量相對(duì)較低;而在細(xì)胞活躍，進(jìn)行DNA的復(fù)制，AgNORs含量顯著升高［3］，這表明隨著DNA含量的增加，AgNORs的含量同時(shí)也在增加，故AgNORs含量的變化可反映rDNA、rRNA的活性變化，進(jìn)而在一定程度上也反映了T淋巴細(xì)胞活性的變化。故通過(guò)檢測(cè)外周血T細(xì)胞AgNORs的含量可以判斷機(jī)體的免疫狀態(tài)。

實(shí)驗(yàn)觀察替比夫定治療前及治療6個(gè)月后HBV-DNA陰轉(zhuǎn)率，肝臟 Child-Push評(píng)分的變化，與 Yao等［4］研究結(jié)果一致，該結(jié)論表明替比夫定可迅速抑制HBV復(fù)制，改善乙型病毒性肝炎后肝硬化患者肝功能。長(zhǎng)期應(yīng)用可明顯改善肝細(xì)胞壞死的嚴(yán)重性改變，并可減輕和阻止肝臟纖維化的進(jìn)展，減少肝硬化并發(fā)癥及肝癌的發(fā)生率。在替比夫定治療6個(gè)月后AgNORs明顯升高，這與國(guó)外慢性乙肝替比夫定治療相關(guān)報(bào)道相一致［5］。該研究結(jié)果表明替比夫定可以改善乙型病毒性肝炎后肝硬化患者的T細(xì)胞免疫活性。何庭宇等認(rèn)為在HBV感染的不同時(shí)期，患者的肝損害與細(xì)胞免疫有密切相關(guān)性［6］，肝臟的破壞程度可以影響到細(xì)胞免疫功能，考慮其原因有可能是:肝功能受損、低白蛋白血癥、營(yíng)養(yǎng)不良均可以出現(xiàn)免疫功能異常，各種細(xì)胞因子以及多種致病因子不同程度作用于T細(xì)胞亞群及其 rDNA活性，表現(xiàn)為 AgNORs活性受到抑制及CD4+輔助性T淋巴細(xì)胞功能減弱，CD8+抑制性T細(xì)胞功能過(guò)度活化。本實(shí)驗(yàn)患者在替比夫定治療后，肝功能好轉(zhuǎn)十分顯著，肝硬化患者病情明顯減輕，從而使患者T淋巴細(xì)胞免疫活性有所恢復(fù)，整體T細(xì)胞免疫反應(yīng)功能增強(qiáng)?；谝陨?，替比夫定改善乙型病毒性肝炎后肝硬化患者T細(xì)胞免疫活性機(jī)制之一可能是肝功能恢復(fù)，白蛋白上升，肝硬化各種并發(fā)癥減少所致，有待于進(jìn)一步探討。AgNORs測(cè)定可以反映肝硬化患者細(xì)胞免疫功能，同樣能夠作為肝硬化患者病情進(jìn)展以及預(yù)后判定的重要指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)患者通過(guò)替比夫定治療后，HBV陰轉(zhuǎn)率十分明顯，病毒復(fù)制被迅速抑制，使乙肝病毒對(duì)機(jī)體的免疫壓力降低，從而使各抑制因素得以減輕，以至于患者T細(xì)胞免疫活性有所恢復(fù)，整體T細(xì)胞免疫反應(yīng)功能增強(qiáng)，故替比夫定糾正乙型病毒性肝炎后肝硬化患者T細(xì)胞免疫功能紊亂又一機(jī)制有可能是替比夫定快速使HBV復(fù)制減弱，病毒對(duì)機(jī)體的免疫抑制降低所致［7］，試驗(yàn)表明T細(xì)胞AgNORs測(cè)定可以作為判斷替比夫定抗病毒治療療效的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用替比夫定雖然有風(fēng)險(xiǎn)，但帶給患者的益處較顯著，通過(guò)6個(gè)月的治療后，HBV-DNA陰轉(zhuǎn)率較高，患者的Child-Push分級(jí)評(píng)分下降，T細(xì)胞免疫活性得到恢復(fù)，肝硬化并發(fā)癥減少，臨床癥狀明顯改善，即有臨床實(shí)用價(jià)值，值得廣泛推廣。由于病例數(shù)量相對(duì)較少，觀察時(shí)間短，對(duì)于延長(zhǎng)替比夫定治療療程對(duì)乙型病毒性肝炎后肝硬化患者T細(xì)胞免疫功能的影響尚不明確，有待于今后進(jìn)一步研究。

［1］中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲(chóng)病學(xué)分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì).病毒性肝炎防治方案［J］.中華肝臟病雜志，2000，6(8):324-329.

［2］葉任高.內(nèi)科學(xué)［M］.5版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2002;460-470.

［3］Sirri V，Roussel P，Hernandez-Verdun D.The AgNOR proteins:qualitative and quantitative changes during the cell cycle［J］.Micron，2000，31(2):121-126.

［4］Yao FY，Bass NM.Lamivudine treatment in patients with severely decompensated cirrhosis due to replicating hepatitis B infection［J］.J Hepatol，2000，33(2):301-307.

［5］Mizukoshi E，Sidney J，Livingston B，et al.Cellular immune responses to the hepatitis B virus polymerase［J］.J Immunol，2004，173(9):5863-5871.

［6］Kweon YO，Goodman ZD，Dienstag JL，et al.Decreasing fibrogenesis:an immunohistochemical study of paired liver biopsies following lamivudine therapy for chronic hepatitis B［J］.J Hepatol，2001，35(6):749-755.

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