張曉燕，李志強(qiáng)，李領(lǐng)川，劉艷麗

(1.洛陽市環(huán)保設(shè)計(jì)研究所，洛陽471000;2.洛陽市澗西污水處理廠，洛陽471000;3.中州大學(xué)實(shí)驗(yàn)管理中心，鄭州450044)

抗生素(antibiotics)是生物(包括微生物、植物和動(dòng)物)在其生命活動(dòng)過程中所產(chǎn)生的、或由其他方法獲得的，能在低微濃度下有選擇地抑制或影響它種生物功能的有機(jī)物質(zhì)。［1-2］20世紀(jì)70年代以來，抗生素的廣泛而大量應(yīng)用及濫用所導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性已成為威脅人類的焦點(diǎn)問題［3］。我國是抗生素的生產(chǎn)和使用大國，抗生素濫用現(xiàn)象尤為嚴(yán)重，醫(yī)用、畜用、水產(chǎn)養(yǎng)殖及醫(yī)藥工業(yè)廢水中的抗生素不能得到有效處理使水資源安全利用的巨大挑戰(zhàn)。目前，水環(huán)境中抗生素的色譜檢測技術(shù)有高效液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS/MS)技術(shù)［4］、高效液相色譜-紫外吸收(HPLC-UV)檢測技術(shù)［5］和高效液相色譜-熒光(HPLC-FD)檢測技術(shù)［6］。本文采用超高效液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLCMS/MS)測定水體中12種抗生素，取得了良好的效果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

ACQUITY超高效液相色譜系統(tǒng)，配TQD三重四極桿質(zhì)譜檢測器(美國Waters公司);Milli-Q超純水器(美國Millipore公司);.022umPTFE針式過濾器(上海安普科學(xué)儀器有限公司);AS3120B型數(shù)控超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。

甲醇、甲酸均為色譜純，購自美國TEDIA;其余試劑為分析純;實(shí)驗(yàn)室用水為Milli-Q制備的超純水;實(shí)際水樣采自某地下井水，某污水處理廠進(jìn)、出口，某醫(yī)院廢水排出口。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

分別準(zhǔn)確稱取12種抗生素固體標(biāo)準(zhǔn)品，加入適量甲醇超聲溶解，配置成質(zhì)量濃度為10mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，儲(chǔ)備待用。移取適量10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇稀釋成0.1 mg/L的中間液。用10%甲醇稀釋，分別配置質(zhì)量濃度為 0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、25.0、50.0 ug/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。再配置質(zhì)量濃度分別為1.0、10.0 ug/L的質(zhì)量控制溶液。

1.2.2 UPLC 條件

色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm，1.7 um;美國 Waters公司);柱溫:40 ℃;進(jìn)樣體積:10 uL;流動(dòng)相 A:甲醇;流動(dòng)相 B:水(含0.1%(v/v)甲酸);流速:0.3 mL/min。梯度程序:0～1 min，10%A;1 ～1.5 min，10%A ～45%A;1.5 ～3 min，45%A ～55%A;3～4 min，55%A ～65%A;4～5 min，65%A ～95%A;5 ～6 min，95%A;6.1 ～10 min，95%A ～10%A。

1.2.3 MS/MS 條件

采用電噴霧離子源，正離子多反應(yīng)檢測(MRM)模式。毛細(xì)管電壓為0.5 kv，離子源溫度為120℃，脫熔劑氣(氮?dú)?溫度為350℃，脫溶劑氣流速為650 L/hr，碰撞氣流速為50 L/hr。12種抗生素的檢測離子、錐孔電壓(cone voltage)和碰撞能量(collision energy)見表1。

表1 12種抗生素的UPLC-MS/MS分析參數(shù)Table 1 UPLC-MS/MS parameters of 12 antibiotics

2 結(jié)果與討論

2.1 UPLC-MS/MS條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)使用ACQUITY UPLC BEH C18柱(50mm ×2.1 mm，1.7 um;美國 Waters公司)，待測物質(zhì)分離良好且峰形對稱，12種抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖見圖1。

對12種抗生素，采用調(diào)諧的方法確定最佳錐孔電壓和碰撞能量。將10ug/L的12種抗生素類藥物的標(biāo)準(zhǔn)溶液以10 ul/min的流速連續(xù)注射進(jìn)入ESI離子源中。在正離子檢測模式下對12種藥物進(jìn)行一級質(zhì)譜分析(MS SCAN)，得到母離子［M+H+］峰，逐步改變錐孔電壓，觀察質(zhì)譜響應(yīng)信號，分別選擇合適的錐孔電壓;再對母離子峰進(jìn)行二級質(zhì)譜分析(MSMS SCAN)，調(diào)節(jié)優(yōu)化碰撞能量，得到碎片離子信息;選擇響應(yīng)值高、極限噪音低的離子對作為監(jiān)測離子對(定性離子對)，最終選擇響應(yīng)值高，峰形對稱的子離子作為定量離子。由于12種抗生素出峰較為分散，因此采用MRM模式時(shí)，數(shù)據(jù)采集采用分段采集模式以便提高靈敏度。通過以上方法確定了1.2.3節(jié)所述的質(zhì)譜條件。

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 線性關(guān)系、檢出限和定量限

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，對質(zhì)量濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、25.0、50.0 ug/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測定，以質(zhì)量濃度為(x)為橫坐標(biāo)，峰面積(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行曲線回歸，在0.1～50ug/L范圍內(nèi)，12種抗生素均呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果見表2。

表2 12種抗生素的線性方程和相關(guān)系數(shù)

2.2.2 準(zhǔn)確度、精密度實(shí)驗(yàn)

以實(shí)驗(yàn)室純水為基質(zhì)，采用加標(biāo)回收法進(jìn)行回收率和精密度試驗(yàn)，添加2.0、10.0ug/L 2個(gè)水平濃度，每個(gè)水平重復(fù)測定7次，平均回收率為90.9%～113.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為 1.86% ～7.87%(見表 3)。

表3 12種抗生素類藥物的加標(biāo)回收率與精密度

2.3 實(shí)際樣品的分析

采用本方法對某地下水，某污水處理廠進(jìn)口、出口生活污水，某肛腸醫(yī)院廢水實(shí)際水樣進(jìn)行分析，測定效果好，實(shí)用性強(qiáng)，完全能滿足環(huán)境水體中12種抗生素檢測要求，測定結(jié)果見表4。

表4 實(shí)際水樣中12種抗生素測定結(jié)果(ug/L)

3.結(jié)語

本文所建立的UPLC-MS/MS方法可同時(shí)檢測地下水、生活污水、醫(yī)院廢水中12種抗生素藥物的含量，操作簡單、快速，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于水中抗生素類藥物殘留的定性定量分析。

圖1 12種抗生素子離子流圖

［1］Wai O W H.A lid-driven elongated annular FLUME(LEAF)for the Determination of Sediment Transport Properties［C］//Gyr A，Kinzelbach W.Sedimentation and Sediment Transport，Proceedings of the Monte Verità Symposium.Switzerland:Kluwer Academic Publishers，2002:241-244.

［2］Chan W Y，Wai O W H，Li Y S.Critical shear stress for deposition of cohesive sediments in Mai Po［J］.Journal of Hydrodynamics，Ser.B，2006，18(3):300-305.

［3］劉小云，舒為群.水中抗生素污染現(xiàn)狀及檢測技術(shù)研究進(jìn)展［J］.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2005，15(8):1011-1014.

［4］Roman H，Thomas T，Klaus H，et al.Occurrence of antibiotics in the aquatic environment［J］.Sci Total Environ，1999，225:109-118.

［5］Esther T，Guy B，Adela RR.Trace enrichment of(fluoro)quinolone antibiotics in surface waters by solid-phase extraction and their determination by liquid chromatographyultraviolet detection［J］.J.Chromatogr A，2003，1008:145-155.

［6］Eva MG，Alfredo CA，Andreas H，et al.Trace determination of fluoroquinolone antibacterial agents in urban wastewater by solid-phase extraction and liquid chromatography with fluorescence detection［J］.Anal Chem，2001，73:3632-3638.