薛 梅，李彥希，史丙俊，王祖紅，江 陽，唐海燕

（重慶市中醫(yī)院皮膚科，重慶 400011）

炎癥后色素沉著是激光治療的常見并發(fā)癥，其發(fā)病率的不可預測、病程的不一致、預后的不確切等因素，非常困擾醫(yī)師和患者。如何有效預防炎癥后色素沉著的發(fā)生，已經(jīng)成為臨床工作中非常需要解決的問題。

本實驗用Q開關(guān)Nd：YAG激光處理豚鼠背部皮膚，之后用參苓白術(shù)散加減顆粒對其干預，探討參苓白術(shù)散加減顆粒對激光術(shù)后色素沉著的影響。

1 材料和方法

1.1 動物

動物為成年健康豚鼠，一級英國短尾豚鼠，批號[川實動管質(zhì)第17號]，共50只，體重250～280g，由瀘州醫(yī)學院實驗動物中心提供，飼養(yǎng)條件一級。

1.2 中藥

參苓白術(shù)散加減顆粒由瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院制劑科制備，呈淡褐色顆粒狀，共由黃芪、黨參、白術(shù)、茯苓、山藥、蓮子、枸杞子、當歸、桔梗等九味中藥組成。每袋參苓白術(shù)散加減顆粒10克，相當于生藥19.2克。

1.3 試劑

SOD測定試劑盒、CAT測定試劑盒、MDA測定試劑盒，均購自南京建成生物研究所。SV總RNA提取試劑盒（Promega），Access RT-PCR試劑盒（Promega），pGEM DNA標準參照物（Promega），焦碳酸二乙酯（DEPC）（Fluka）。特異引物由中國科學院上海細胞所合成，引物序列如下：鼠酪氨酸酶：5’-TTCAAAGGGGTGGATGACCG-3’.5’-GACACATAGTAATGCATCC-3 ‘（319 bp）；鼠β-肌動蛋白：5’-TCAGAAGGACTCCTATG- TCG-3’，5’-TCTCTTTGATG TCACGCACG-3’（500 bp）。Perkin-Elmer Cetus熱循環(huán)儀（美國Perkin-Elmer公司），White/Ultroviolet Transilluminator凝膠掃描儀（美國Gene公司）。其余有關(guān)試劑及材料均為進口或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.4 方法

取健康成年豚鼠50只，體重250～280g，雌雄不拘以重量隨機分為參苓白術(shù)散加減顆粒高劑量組、低劑量組、維生素（E+C組）、生理鹽水組和激光對照組共五組，每組各10只。

1.4.1 對豚鼠進行激光處理 選取每只豚鼠背部脊柱兩側(cè)四處每塊約2×2cm范圍，分別用Q開關(guān)Nd：YAG激光進行照射，參數(shù)設(shè)置為：波長：1064nm，能量密度：1.5J/cm2，脈沖寬度：10ns，光斑直徑：3mm。

1.4.2 取材 激光照射前和照射后即刻，分別對實驗組激光照射區(qū)域與對照豚鼠背部相應部位取皮膚組織活檢，用手術(shù)刀切取長約1.5cm，寬約1cm，厚約0.3cm大小的組織塊，將取下的組織塊以10%甲醛液固定，石蠟包埋，做成石蠟塊備用。同時經(jīng)每只豚鼠心臟抽血5ml，注入到預冷的加有促凝劑的試管中混勻，分離血清后，置于低溫冰箱保存待檢。

1.4.3 藥物治療 激光照射并取皮膚活檢后，按上訴治療前的分組，對豚鼠進行參苓白術(shù)散加減顆粒低劑量、高劑量、維生素E+C、生理鹽水灌胃，劑量分別為0.3g/kg，2g/kg，30mg/kg，4ml/kg。每天兩次，連續(xù)四周。在灌胃后第四周于激光照射區(qū)域邊緣如前法切取豚鼠皮膚組織進行活體檢查，組織塊仍以10%甲醛液固定，石蠟包埋做成石蠟塊備用；同時如前法抽取豚鼠心臟血5ml，分離血清后置于低溫冰箱保存待檢。

1.4.4 HE染色 將制成的石蠟組織塊切片（5μm）、表片、吹片（約30分鐘），脫蠟，用蘇木素、伊紅染色，脫水，透明，封片，光鏡下觀察。

將制成的石蠟組織塊切片（5μm）、表片、吹片（約30分鐘），進行脫蠟，水洗，將切片置于新鮮配置的0.037mol/l（1%）的氯化鐵35ml，新鮮配置的0.03mol/l（1%）的鐵氰化鉀4ml，蒸餾水6ml組成的混合液中放置10分鐘，將切片放入1%藏花紅液體中30秒鐘，水洗，常規(guī)脫水、透明、封片。光鏡下觀察。

1.4.5 檢測SOD、CAT、MDA 用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD、用可見光法檢測CAT，用硫代巴比妥酸即TBA法檢測MDA。

1.4.6 局部皮膚所含黑素顆粒結(jié)果判斷 每張切片隨機選取5個互不重疊的視野，找到陽性目標（皮膚表皮和附件上皮細胞胞漿中呈現(xiàn)棕黃色、黑色顆粒）后，用CMIAS系列98A型圖像分析系統(tǒng)對目標圖像進行等量分析，得出每張切片5個視野黑黑素顆粒的平均面積、目標與統(tǒng)計場面積之比（面密度）。

1.4.7 RT-PCR檢測 1）總RNA提?。簯胹v總RNA提取試劑盒，按照試劑盒說明提取總RNA。2）RT-PCR：應用Access RT-PCR試劑盒，建立RT-PCR反應體系50μl，無核酶水20μl，AMV/Tfl 5×反應液10μl，0.2mmol/L dNTP混合液（10mmol/L每種dNTP1μl），1pmol/L特異性上游引物（10pmpl/μl）5μl，和1pmol/L特異性下游引物（10pmol/μl），25mmol/L MgSO4，2μl（終濃度1mmol/L），AMV逆轉(zhuǎn)錄酶（5U/μl）1μl，Tfl DNA聚合酶（5U/μl）1μl，RNA模板5μl。反應程序：48℃45min 1個循環(huán)，94℃ 30s、60℃ 1min、68℃ 2min，40個循環(huán)，68℃ 7min，1個循環(huán)。4℃儲存?zhèn)溆谩?）PCR產(chǎn)物分析：取PCR擴增產(chǎn)物10μl在含0.5ml溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳完畢后再凝膠掃描儀上觀察結(jié)果。拍照記錄并用Lab works 3.0軟件對擴增產(chǎn)物進行光密度分析。酪氨酸酶基因表達水平以光密度指數(shù)（ODI）表示即酪氨酸酶mRNA A值/β-肌動蛋白mRNA A值。

1.4.8 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件包進行分析，檢測結(jié)果以均數(shù)±標準差（）表示，統(tǒng)計方法采用單因素方差分析和t檢驗分析，組間均值兩兩比較用SNK法，檢驗水平а=0.05。

2 結(jié)果

2.1 豚鼠背部皮膚的肉眼、組織學觀察

2.1.1 肉眼觀察 剃除豚鼠背部毛發(fā)，激光處理后即刻可見處理部位變白，激光處理后一周可見灰色薄痂；生理鹽水組激光處理一月后照射部位邊緣出現(xiàn)較多黑素斑點，維生素組也在相同部位出現(xiàn)少量黑素斑點，中藥低劑量及高劑量組激光照射部位仍為白色，未發(fā)現(xiàn)明顯的黑素斑點。

2.1.2 組織學觀察 在光鏡下正常豚鼠皮膚顯示表皮、真皮結(jié)構(gòu)正常，可見表皮基底層和毛囊處較多黑素顆粒；激光處理后即刻見表皮角質(zhì)層脫落，未見黑素顆粒；激光處理后一月中藥高劑量組未見明顯黑素顆粒，毛囊處未見黑素顆粒；低劑量組見少量黑素顆粒，毛囊處未見黑素顆粒；維生素組見少量黑素顆粒，毛囊處未見黑素顆粒；生理鹽水組和激光對照組基底層出現(xiàn)大量黑素顆粒，毛囊處未見黑素顆粒。

2.2 S chmorl染色

光鏡下可見黑素顆粒被染成棕黃色、黑色顆粒。豚鼠黑色皮膚可見較多黑素顆粒，激光處理后即刻未見黑素顆粒，生理鹽水組一月時切片可見基底層和棘細胞層有大量黑素顆粒，黑素顆粒量多密集，著色很深，且多呈黑色。中藥低劑量組和維生素組一月時切片也可見基底層和棘細胞層黑素顆粒增加。中藥高劑量組治療一月后僅在基底層見到少量的黑素顆粒。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析結(jié)果

2.3.1 治療一月后藥物對皮膚黑素顆粒的影響 治療一月后，中藥高劑量組豚鼠有兩只死于意外，維生素組有一只死于意外，其余豚鼠均進行活體取材，經(jīng)Schmorl染色制成病理切片在高倍鏡（×40）下每張切片隨機選取5個互不重疊的視野，找到陽性目標（皮膚表皮和附件上皮細胞胞漿中呈現(xiàn)棕黃色、黑色顆粒）后，用CMIAS系列98A型圖像分析系統(tǒng)對目標圖像進行定量分析，得出每張切片5個視野黑素顆粒的平均面積、目標與統(tǒng)計場面積之比（面密度）。見表1、表2。

表1 藥物治療一月后豚鼠皮膚中黑素顆粒面積（）

表1 藥物治療一月后豚鼠皮膚中黑素顆粒面積（）

組別 N 目標面積（um2）生理鹽水組 50 6564.9±2231.9●維生素組 45 3259.8±1433.7△▲中藥高劑量組 40 506.5±395.6★中藥低劑量組 50 1220.2±659.5△▲激光對照組 50 10646.9±2008.4

單因素方差分析：F=795.438，X2組間=133518.207，X2組內(nèi)=167.855，P=0.000。SNK：▲與激光對照組相比，P=0.000；△與生理鹽水組比較，P=0.000；●與中藥顆粒高劑量組比較，P=0.000；★與維生素組之間比較，P=0.000。

表2 藥物治療一月后豚鼠皮膚中黑素顆粒面密度（）

表2 藥物治療一月后豚鼠皮膚中黑素顆粒面密度（）

組別 N 面密度生理鹽水組 50 0.015±0.005●維生素組 45 0.007±0.003△▲中藥高劑量組 40 0.001±0.000★中藥低劑量組 50 0.003±0.001△▲激光對照組 50 0.025±0.005

單因素方差分析：F=26.069，X2組間=0.587，X2組內(nèi)=0.023，P=0.000。SNK：▲與激光對照組相比，P=0.000；△與生理鹽水組比較，P=0.000；●與中藥高劑量組比較，P=0.000；★與維生素E+C組之間比較，P＜0.05。

2.3.2 血清中SOD的檢測結(jié)果（見表3）。

表3 治療30天后各組豚鼠血清中SOD的水平比較（）

表3 治療30天后各組豚鼠血清中SOD的水平比較（）

組別 N SOD（U/ml）生理鹽水組 50 121.14±29.02●維生素組 45 146.16±15.67△▲中藥高劑量組 40 164.71±7.69★中藥低劑量組 50 147.21±16.87△▲激光對照組 50 118.97±28.28

單因素方差分析，F(xiàn)=18.455，X2組間=9211.753，X2組內(nèi)=499.148，P=0.000.SNK：▲與激光對照組相比，P=0.000；△與生理鹽水組比較，P=0.001；●與中藥高劑量組比較，P=0.000；★與維生素組之間比較，P=0.014。

2.3.3 血清中CAT的檢測結(jié)果（見表4）。

表4 治療30天后各組豚鼠血清中CAT的水平比較（）

表4 治療30天后各組豚鼠血清中CAT的水平比較（）

組別 N CAT（U/ml）生理鹽水組 50 5.35±2.42●維生素E+C組 45 12.68±6.22△▲中藥高劑量組 40 17.06±3.40★▲中藥低劑量組 50 11.39±5.24△▲激光對照組 50 5.19±2.27

單因素方差分析，F(xiàn)=42.588，X2組間=642.548，X2組內(nèi)=15.098，P=0.000。SNK：▲與激光對照組相比，P=0.000；●與中藥高劑量組比較，P=0.000；△與生理鹽水組比較，P=0.000；★與維生素組比較，P=0.001。

2.3.4 血清中MDA的檢測結(jié)果（見表5）。

表5 治療30天后各組豚鼠血清中MDA的水平比較（）

表5 治療30天后各組豚鼠血清中MDA的水平比較（）

組別 N MDA（nmol/ml）生理鹽水組 50 10.85±0.56●維生素E+C組 45 10.61±0.47▲中藥高劑量組 40 10.20±0.33★☆中藥低劑量組 50 10.54±0.49▲激光對照組 50 11.05±0.57

單因素方差分析，F(xiàn)=10.802，X2組間=2.535，X2組內(nèi)=0.535，P=0.000。SNK：▲與激光對照組相比，P=0.005；☆與激光對照組相比，P=0.000；●與中藥高劑量組比較，P=0.000；★與維生素組比較，P=0.013。

2.3.5 中藥對酪氨酸酶mRNA水平的影響 組織標本抽提總RNA及RT-PCR擴增發(fā)現(xiàn)口服中藥使豚鼠酪氨酸酶mRNA水平下降，與維生素E+C組、激光對照組和生理鹽水組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），結(jié)果見表6、圖1。

表6 治療一月后豚鼠皮膚酪氨酸酶mRNA表達水平（）

表6 治療一月后豚鼠皮膚酪氨酸酶mRNA表達水平（）

＊：與激光對照組相比，P＜0.01

光密度指數(shù)組別 n t值＊生理鹽水組 10 0.57±0.09激光對照組 10 0.68±0.08維生素組 9 0.49±0.08 5.46中藥高劑量組 8 0.46±0.06 6.34中藥低劑量組 10 0.61±0.07 3.91

3 討論

多年來，大量研究證實氧自由基（OFR）與皮膚黑素的形成和色素沉著關(guān)系密切[2][3]。正常情況下，體內(nèi)有許多氧自由基清除劑，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化酶（GSH-PX）、谷胱甘肽（GSH）等，體內(nèi)的氧化與抗氧化處于平衡狀態(tài)。當脂質(zhì)過氧化物（LPO）增強或自由基增多時，可使脂類形成脂質(zhì)過氧化物（LPO）引起脂質(zhì)過氧化作用，LPO作為啟動因素使酪氨酸系列氧化反應加速，黑素形成增多；LPO極不穩(wěn)定，分解產(chǎn)生具有強氧化作用的丙二醛（MDA），使蛋白質(zhì)分子發(fā)生分子內(nèi)和分子間交聯(lián).形成熒光發(fā)色團（fluorescent chromophore）即黑素。

Sichel G等[4]在試驗中發(fā)現(xiàn)當動物肝臟中黑素含量非常高時SOD酶線粒體的活性消失了；而當肝臟中黑素含量降低時SOD酶線粒體的活性也按照比例升高。Maresca V等[5]對UV照射后黑素類型和抗氧化系統(tǒng)之間的可能關(guān)聯(lián)進行了分析，得出結(jié)果超氧化物歧化酶和過氧化氫的活性與表皮重建的類型相關(guān)，合成的黑素能放大過氧化氫酶對特定靶目標的效應。Mastore M等[6]發(fā)現(xiàn)過氧（化）物酶-過氧化氫系統(tǒng)的加入和相關(guān)的ROI介導的反應在黑素細胞和黑素蛋白生成過程中具有明顯提高作用。Wozniak A[7]在文章中指出在黑素生成的過程中自由基也在增殖，并通過研究黑素生成在B19 黑素瘤的脂質(zhì)過氧化反應和在挑選出的黑色C57BL/6J小鼠組織中的抗氧化能力中的作用，發(fā)現(xiàn)載有移植B16黑素瘤的小鼠組織中抗氧化應激提高了。

SOD的活力高低間接反映了機體清除氧自由基的能力，而MDA的高低又間接反映了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度，因此MDA的測定常常與SOD的測定相互配合。本實驗對重要的抗氧化酶SOD、CAT和與之配合的氧化酶MDA進行檢測，并且發(fā)現(xiàn)抗氧化酶活力提高，氧化酶活力降低與黑素延遲沉著有關(guān)，再次證明了氧化酶與抗氧化酶系統(tǒng)在黑素產(chǎn)生中的作用。

在臨床治療中，皮膚科醫(yī)師和美容醫(yī)師經(jīng)常會發(fā)現(xiàn)激光術(shù)后有色素沉著。多數(shù)學者認為激光術(shù)后色素沉著原因在于激光的色基也就是靶目標是黑素顆粒而不是產(chǎn)生黑素體的黑素細胞，所以在黑素細胞重新生成黑素顆粒之后會再次出現(xiàn)癥狀[8]。Dover JS觀察到Q開關(guān)紅寶石激光處理后的豚鼠皮膚在4個月后再次出現(xiàn)黑素沉著，并認為這說明激光治療的靶目標即黑素仍潛在存在[9]。

本實驗通過檢測豚鼠血清中氧化與抗氧化酶的變化，并對豚鼠皮膚黑素沉著情況進行觀察，發(fā)現(xiàn)了二者之間存在關(guān)聯(lián)，即抗氧化酶受到抑制，而氧化酶增多時，黑素沉著發(fā)生的可能更大，程度更深；相反則黑素沉著的程度會減輕。說明在激光術(shù)后確實存在仍然可以產(chǎn)生黑素的黑素細胞，這與Dover JS觀點一致[10]。而且可以通過調(diào)整氧化-抗氧化系統(tǒng)抑制激光術(shù)后的黑素沉著。

祖國醫(yī)學認為色素沉著以情志不遂，勞傷脾土，腎精虧損，外受風邪為病因，與肝、脾、腎三臟關(guān)系密切，病機有肝郁氣滯、脾虛肝郁、肝腎陰虛，治法為疏肝理氣、化淤消斑，健脾舒肝、調(diào)和氣血，滋補肝腎、育陰消斑。用藥以白芷、白芨、白附子、白僵蠶、珍珠、當歸、益母草、白蘞、花粉、白茯苓、荊芥、冬瓜仁、杏仁等多見[9]。李洪武等[11][12][13]通過動物和臨床實驗，篩選出了對黑素沉著有明顯抑制作用的中藥和方劑，其中白術(shù)、茯苓、山茱萸與臨床常用脫色劑氫醌比較，差異無顯著性（P＞0.05）。

中醫(yī)認為燒燙傷后肌膚受損，傷及肌膚脈絡(luò)和肌肉，氣血受阻，濕濁積聚，脾肺失調(diào)，肌膚失于榮潤而失色[1]。參苓白術(shù)散加減顆粒由參苓白術(shù)散衍化而來，其主要成分有黃芪、黨參、白術(shù)、茯苓、山藥、蓮子、五味子、枸杞子、當歸、桔梗等，功用益氣健脾，滲濕止瀉。方中黃芪，黨參味甘，歸脾肺經(jīng)，具有補氣益衛(wèi)之功，共為君藥；白術(shù)苦溫，健脾燥濕，加強精氣化生，益氣助運之力；茯苓甘淡，健脾滲濕，與白術(shù)合用，效果更佳；山藥，蓮子助黨參健脾益氣；五味子能斂肺滋腎，加強君藥功效；枸杞子補益肝腎，使精氣充足，加強腎陽化氣功能；當歸甘溫，補血活血效佳，為血中之氣藥，用在本方在于氣隨血生，血載氣行；桔梗苦辛，歸肺經(jīng)，為舟楫之藥，宣肺利氣，以通調(diào)水道，又載藥上行，以益肺氣。黃芪[14]能降低血清脂質(zhì)過氧化物含量，使SOD和CAT活性升高。白術(shù)[15]具有清除自由基和抑制脂質(zhì)過氧化作用。有報道[16]茯苓能影響老年大鼠紅細胞中超氧化物歧化酶（SOD）活性和皮膚中 SOD 活性。近年來的研究結(jié)果表明[14]，五味子中含有五味子酚、五味子丙素以及甲素、乙素等7種木脂素，對大鼠肝細胞有保護作用，能使大鼠肝細胞液中SOD和CAT活性明顯提高。研究表明從枸杞子中提取出枸杞子多糖，證明其具有抗氧化作用[17]。

維生素E和維生素C具有抗氧化[17]、清除自由基[18]的作用，在臨床上常用于治療色素增加性皮膚病[19]，以及作為評價治療黑素沉著藥物療效的標準之一[20]。本實驗結(jié)果中，維生素E和C在一個月的治療后，豚鼠激光術(shù)后皮膚黑素沉著較生理鹽水組少，但SOD、CAT、MDA的改變不如參苓白術(shù)散加減顆粒的明顯，說明參苓白術(shù)散加減顆粒比維生素E和維生素C抗氧化作用更強。但這也可能是因為維生素E和維生素C在體內(nèi)起效緩慢，在給藥時間只有一個月的情況下，維生素E和維生素C還沒有完全起效所致，關(guān)于這方面研究還需要進一步的觀察。

4 結(jié)論

綜上，參苓白術(shù)散加減顆粒對豚鼠激光術(shù)后酪氨酸酶的表達抑制作用強于維生素E和維生素C，參苓白術(shù)散加減顆粒組SOD、CAT兩種酶的活性顯著高于而MDA含量顯著低于其他各組，與肉眼和鏡下觀察到的色素沉著的程度和時間一致，證明參苓白術(shù)散加減顆粒具有很強的抗氧化作用，其作用機理可能與增強SOD、CAT的活性，抑制MDA的產(chǎn)生有關(guān)?？梢赃M一步進行色素沉著皮膚病的臨床療效觀察。

[1]陳杏綺，羅志軍，劉鵬，等.燒傷后面部色素沉著中西醫(yī)結(jié)合治療的臨床效果探討.當代醫(yī)學，2012，8（24）159-161.

[2]余春燕，韓秀珍，張宏明. 超氧化物歧化酶在不同皮膚病的變化.中國皮膚性病學雜志，1994，8（3）：153-154.

[3]唐和平，張其亮，蕭嶸，等.兒茶素治療兔外傷性黑素沉著的作用及機理初探.湖南農(nóng)業(yè)大學學報，1996，22（6）：584-586.

[4]Sichel G，Corsaro C，Scalia M，et al. Relationship between melanin content and superoxide dismutase（SOD）activity in the liver of various species of animals.Cell Biochem Funct，1987，5（2）：123-128.

[5]Maresca V，F(xiàn)lori E，Briganti S，et al. UVA-induced modification of catalase charge properties in the epidermis is correlated with the skin phototype. J Invest Dermatol，2006，126（1）：182-190.

[6]Mastore M，Kohler L，Nappi AJ. Production and utilization of hydrogen peroxide associated with melanogenesis and tyrosinase-mediated oxidations of DOPA and dopamine.FEBS J，2005，272（10）：2407-2415.

[7]Wozniak A，Wozniak B，Drewa G，et al. Lipid peroxidation and antioxidant capacity in selected tissues of healthy black C57BL/6J mice and B16 melanoma-bearing mice.Melanoma Res，2003，13（1）：19-22.

[8]周展超.皮膚美容激光[M].南京：東南大學出版社，2000.

[9]Dover JS，Margolis RJ，Polla LL，et al. Pigmented guinea pig skin irradiated with Q-switched ruby laser pulses. Morphologic and histologic findings. Arch Dermatol，1989；125（1）：43～49

[10]尚靖，敖秉臣，劉文麗，等. 七種增白中藥在體外對酪氨酸酶的影響[J].中國藥學雜志，1995，30（11）：653-655.

[11]李洪武，朱文元，夏明玉. 白術(shù)等對UVB誘導豚鼠皮膚黑素沉著的抑制作用.中華皮膚科雜志，2000，33（6）：386-388.

[12]李洪武，趙健. 部分復方中藥對酪氨酸酶活性影響的實驗研究.江蘇中醫(yī)，1999，20（11）：46-47.

[13]李洪武，朱文元. 治療黃褐斑的中藥復方對酪氨酸酶活性的影響.中華皮膚科雜志，2000，33（2）：93-95.

[14]周劍. 國內(nèi)對抗自由基作用中藥的研究. 中國藥學雜志，1992，27（9）：563-565.

[15]方允中，李文杰. 自由基與酶[M]. 北京：科學出版社，1989.

[16]于凌，徐曉東，吳景東，等. 茯苓延緩大鼠皮膚衰老作用的實驗研究.遼寧中醫(yī)學院學報，2003，5（1）：52-53.

[17]Vandana S，Ram S，Ilavazhagan M，et al. Comparative cytoprotective activity of vitamin C，E and betacarotene against chromium induced oxidative stress in murine macrophages. Biomed Pharmacother，2006，60（2）：71-76.

[18]Duval C，Poelman MC. Scavenger effect of vitamin E and derivatives on free radicals generated by photoirradiated pheomelanin. J Pharm Sci，1995，84（1）：107-110.

[19]Smit N，Vicanova J，Cramers P，et al.The combined effects of extracts containing carotenoids and vitamins E and C on growth and pigmentation of cultured human melanocytes.Skin Pharmacol Physiol，2004，17（5）：238-245.

[20]易運連，饒漢珍，湯愛國. 黃褐斑患者血中超氧化物歧化酶活性、丙二醛和維生素C、E含量的測定.臨床皮膚科雜志，2000，29（6）：332-333.