周梅華，魯 嚴(yán)，李 雪，吳 迪，朱文元

（1.江蘇省工人湯山療養(yǎng)院皮膚科，江蘇 南京 211131；2.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，江蘇 南京 210029；3.南京市婦幼保健院皮膚科，江蘇 南京 210029）

自體黑素細(xì)胞培養(yǎng)移植是治療白癜風(fēng)的一種有效方法，近年來國內(nèi)外有不少使用該方法成功治療白癜風(fēng)的報(bào)道[1]。我們在傳統(tǒng)的黑素細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上對培養(yǎng)基和移植方法進(jìn)行了改進(jìn)，應(yīng)用于白癜風(fēng)的移植治療，取得了較好的效果?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 病例資料

白癜風(fēng)患者均為2011年9月～2012年6月在南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科就診的患者，符合中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會皮膚性病專業(yè)委員會色素病學(xué)組制定的標(biāo)準(zhǔn)。本組患者共13例，年齡18歲～55歲，男8例，女5例，平均病程6.78年，均為穩(wěn)定期尋常型白癜風(fēng)，均無手術(shù)禁忌癥?？偣?1處皮損。試驗(yàn)方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，手術(shù)前患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 黑素細(xì)胞的培養(yǎng)[2]常規(guī)消毒患者供皮區(qū)，局部浸潤麻醉，用無菌刀片采取表皮，漂洗數(shù)次，加入含Dispase酶的D-Hanks液中37℃ 3h，挑棄部分真皮，將組織剪成約0.2cm的小片，用0.25%胰蛋白酶37℃吹打消化20min，再用10%胎牛血清終止消化。用D-Hanks液洗滌細(xì)胞后1500rpm離心10min，收集沉淀細(xì)胞重懸浮于我們前期研制出以rhG-CSF為主要促細(xì)胞增殖因子的Ham F12培養(yǎng)基[3]。細(xì)胞接種密度為5×105/ml，置于5% CO2培養(yǎng)箱37℃孵育。6h后換液去除未貼壁細(xì)胞，48h后改用不含geneticin的培養(yǎng)基，3天換液，當(dāng)細(xì)胞長滿70～80%時(shí)，用2.5 g/L胰酶消化傳代。

1.2.2 黑素細(xì)胞的移植 常規(guī)利多卡因局部浸潤麻醉后，采用表皮磨削機(jī)磨削白斑區(qū)，以點(diǎn)狀出血為宜，后表面覆蓋生理鹽水濕紗布備用。將預(yù)先制備好的黑素細(xì)胞-卡波姆膠混合物[3]輕輕涂抹于受植區(qū)，約0.5cm厚，再覆蓋凡士林油紗布，并加壓包扎固定。10天去除紗布，1個月后開始觀察療效。所有病例均隨訪至少6個月。

1.2.3 療效判斷 采用Adobe Photoshop 7.0圖像軟件系統(tǒng)評估復(fù)色面積，療效判斷參照許愛娥[4]：包括痊愈：色素恢復(fù)面積≥90%；顯效：50%≤色素恢復(fù)面積＜89%；好轉(zhuǎn)：10%≤色素恢復(fù)面積＜49%；以及無效：色素恢復(fù)面積＜10%。有效率=痊愈率+顯效率。

表1 體外培養(yǎng)自體黑素細(xì)胞移植治療白癜風(fēng)臨床效果統(tǒng)計(jì) 處（%）

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS l6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 黑素細(xì)胞培養(yǎng)

黑素細(xì)胞接種培養(yǎng)瓶后，逐漸貼壁、拉長并出現(xiàn)偽足和分支，約7天后呈現(xiàn)典型的黑素細(xì)胞形態(tài)。根據(jù)皮損面積大小和所需黑素細(xì)胞數(shù)目，行黑素細(xì)胞計(jì)數(shù)與傳代。

2.2 黑素細(xì)胞移植效果

移植1個月后觀察15處皮損有明顯的色素產(chǎn)生，6處皮損2個月后產(chǎn)生色素。除1例患者為點(diǎn)狀復(fù)色，其余為均勻復(fù)色形式，無明顯斑駁現(xiàn)象，且產(chǎn)生的色素?zé)o脫失現(xiàn)象（圖1）。3個月后，13例21處皮損痊愈8處，顯效11處，好轉(zhuǎn)2處，無效0處，總有效率90.48%。見表1。所有病例均隨訪至少6個月，未出現(xiàn)疤痕、過敏和其他不良反應(yīng)。

圖1 體外培養(yǎng)自體黑素細(xì)胞移植治療白癜風(fēng)前后對比

3 討論

黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)自1987年開始用于移植治療白癜風(fēng)，成為白癜風(fēng)治療較先進(jìn)的方法之一。傳統(tǒng)的表皮移植治療白癜風(fēng)操作簡單，但移植面積相對較小，且移植成活區(qū)皮膚易出現(xiàn)“鵝卵石”樣外觀，與周邊正常皮膚不易融合。而黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)具有細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)量多，移植面積大等優(yōu)點(diǎn)。傳統(tǒng)黑素細(xì)胞培養(yǎng)基是應(yīng)用TPA和CT[5]，刺激黑素細(xì)胞的增殖，增加樹突，促進(jìn)黑素細(xì)胞的附著。但由于TPA具有強(qiáng)致癌性，CT作為一種神經(jīng)毒素，所培養(yǎng)的黑素細(xì)胞安全性受到質(zhì)疑，臨床應(yīng)用受到限制。Hu培養(yǎng)基[1]使用bFGF、HGF等代替TPA、CT，解決了細(xì)胞安全性的問題，但是bFGF、HGF價(jià)格昂貴，增加了細(xì)胞培養(yǎng)成本，給患者帶來經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。前期研究我們已證實(shí)人黑素細(xì)胞表面可表達(dá)G-CSFR，G-CSF通過與黑素細(xì)胞表面的G-CSFR結(jié)合，具有較強(qiáng)的促黑素細(xì)胞增殖的能力[6]。G-CSF是一種人體的生理性細(xì)胞因子，可由單核巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等誘導(dǎo)產(chǎn)生。其基因重組產(chǎn)品（rhG-CSF）被廣泛用于各種白細(xì)胞減少癥、神經(jīng)保護(hù)等[7]，該產(chǎn)品安全性高，價(jià)格便宜，容易獲得，因此我們創(chuàng)建了以rhG-CSF為主要細(xì)胞增殖因子的新型黑素細(xì)胞培養(yǎng)基。在細(xì)胞移植技術(shù)方面，我們也進(jìn)行了改良，通常采用細(xì)胞懸液滴種法移植黑素細(xì)胞，但懸液具有流動性，會造成黑素細(xì)胞在白斑區(qū)不易附著，導(dǎo)致遠(yuǎn)期達(dá)不到均勻復(fù)色，影響美觀。我們以卡波姆膠作為黑素細(xì)胞的載體可以克服上述缺點(diǎn)，能夠均勻涂布于皮膚組織，取得了良好的療效。本研究結(jié)果提示，采用新型黑素細(xì)胞培養(yǎng)基及卡波姆膠系統(tǒng)可以用于體外培養(yǎng)黑素細(xì)胞移植治療白癜風(fēng)，具有培養(yǎng)黑素細(xì)胞數(shù)量多、移植后色素恢復(fù)均勻、安全等優(yōu)點(diǎn)，值得臨床推廣和應(yīng)用。

[1]Hu DN，McCormick SA，Seedor JA，et al. Isolation，purification and cultivation of conjunctival melanocytes.Exp Eye Res，2007，84（4）：655-662.

[2]Mulekar SV. Melanocyte–keratinocyte cell transplantation for stable vitiligo. Int J Dermatology，2003，42（2）：132-136.

[3]魯嚴(yán)，周梅華，李雪，等.新型黑素細(xì)胞涂布法移植卡波姆膠載體制備研究.中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志，2012，11（4）：208-210.

[4]張迪敏，洪為松，傅麗芳，等.個體化培養(yǎng)自體黑素細(xì)胞移植治療白癜風(fēng). 中華皮膚科雜志，2010，43（10）：721-725.

[5]Kim D S，Park SH，Park C. Transforming growth factorbeta1 de-creasesmelanin synthesis via delayed extracellular signal-regulated kinase activation[J].Int JBiochem CellBio，2004，36（8）：1482-1491.

[6]周梅華，李雪，魯嚴(yán)，等粒細(xì)胞集落刺激因子及其受體對人黑素細(xì)胞增殖及酪氨酸酶活性的影響，2012，45，（8）：564-568.

[7]Ringden OT，Le-Blane K，Remberger M. Granulocyte and granulocyte-macrophage colony-stimulating factors in allografts：Uses，misuses，misconceptions，and future applications. Exp Hematol，2005，33（5）：505-512.