葛新發(fā)，董貴俊，王玉站，李可峰，潘衛(wèi)東

1.Shandong Sports University，Jinan 250102，China；2.Institute of Electrical Engineering，CAS，Beijing 100190，China.

重復(fù)大強度訓(xùn)練已經(jīng)成為提高運動員競技能力的一種重要手段，不同時間間隔的訓(xùn)練會導(dǎo)致運動員不同訓(xùn)練效果的累積，同時合理間隔時間進行類似強度運動會促進骨骼肌損傷修復(fù)［6，10］。一次大強度運動后，骨骼肌泛素蛋白酶體途徑基因表達升高，骨骼肌收縮蛋白降解增加，說明骨骼肌損傷修復(fù)中蛋白質(zhì)合成與降解水平也發(fā)生著顯著變化［2，3］；重復(fù)大強度運動導(dǎo)致骨骼肌肌節(jié)重塑，導(dǎo)致重復(fù)運動后肌肉損傷減輕，且線粒體的恢復(fù)速度先于肌節(jié)重建［1］，提示能量代謝的恢復(fù)可能對骨骼肌損傷修復(fù)具有一定意義［14］。但是，重復(fù)運動引起骨骼肌損傷修復(fù)過程中蛋白質(zhì)組變異情況尚不清楚。本研究通過對Wistar大鼠進行一次大強度離心運動及一周后重復(fù)運動訓(xùn)練，并在運動后即刻0h、24h、48h、72h、168h股四頭肌蛋白質(zhì)組進行研究，分析重復(fù)大強度運動后骨骼肌損傷修復(fù)過程中存在的與能量代謝、細胞損傷修復(fù)及細胞結(jié)構(gòu)蛋白相關(guān)特異蛋白，探討重復(fù)運動對骨骼肌損傷修復(fù)過程中可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物飼養(yǎng)、分組及運動方案

72只5周齡雄性Wistar大鼠，體重163±11g，購自山東大學(xué)實驗動物中心（生產(chǎn)許可證號：SCXK（魯）20090001）。實驗前大鼠均未進行過跑臺運動，大鼠飼養(yǎng)一周后，隨機分為正常對照組（CK，6只）、一次離心運動組（A組，30只）和重復(fù)離心運動組（B組，30只）3組，剩余6只大鼠備用。一次離心運動組采取速度為18 m／min、坡度－16°的下坡跑，先運動30 min 休息5 min，再運動30 min，共運動60 min。重復(fù)離心運動組在一次運動結(jié)束1周后再次進行運動（運動2 次）。對照組不運動。動物訓(xùn)練在山東體育學(xué)院運動人體科學(xué)重點實驗室動物實驗室（濟南）進行，分別于一次離心運動和重復(fù)運動后即刻、24 h、48h、72h和168h 將大鼠處死（每次處死6只），取 大鼠股四頭肌備用。

1.2 雙向電泳的樣品制備

取肌肉200 mg，洗凈煎碎后加入W1 緩沖液570μl（W1緩沖液：蔗糖8.56g，1M Tris－HCl（pH7.5）2 ml，0.1 M EGTA 10ml，0.1M PMSF 1ml，加ddH2O 定容至60 ml標(biāo)記為S，60ml S ＋ddH2O 定容到100 ml），巰基乙醇60 μl，研磨成勻漿后，加入W2 緩沖液570μl（W2緩沖液：60 ml S＋40ml 10%Triton 至100ml，即為W2。），繼續(xù)研磨。充分勻漿后分裝入1.5ml EP 管中，10 000g 4℃離心10 min，取上清。按上清液與TCA 的比例4∶1 加入TCA 溶液，搖勻，放于冰上沉淀40 min以上。15 000g 4℃離心10min，棄上清，留沉淀，即為蛋白樣品。將蛋白樣品換入稱好重量的EP管中。用W3清洗蛋白，然后15 000g 4℃離心10min，棄上清，反復(fù)清洗、離心3 次。將樣品放入真空干燥器中抽干，稱蛋白的重量，然后將樣品－20℃保存待用。用Bradford法對標(biāo)本蛋白含量進行定量［8］，蛋白濃度按每管2mg分裝，－80℃冰箱保存待用。

1.3 樣品水化

將樣品用10ml Lysis緩沖液（Lysis buffer：7M 尿素Urea，2M 硫脲thiourea，4%CHAPS，先加3 ml ddH2O 溶 解，溶解之后再加2%Ampholine（pH3.5～10）0.2 ml，定容至10ml）溶解，樣品和Lysis的比例為1∶50，即1mg樣品加50μl Lysis。樣品放入振蕩器充分溶解，大約40min以上。20 000g 4℃ 離心20 min。取出膠條在室溫中緩沖10 min。將樣品加入水化盤中，揭開膠條的保護膜后，將膠條蓋在樣品上，每根膠條蓋上3ml礦物油，水化12h以上。

1.4 雙向電泳操作程序

等電聚焦電泳程序步驟：300 V1h，600 V2h，1 000 V 1h，8 000V1h（梯度），8 000V，4h，500V，20h，累計51 900Vh。SDS－PAGE 步驟：等電聚焦結(jié)束前1h，封板制膠平衡，SDS－PAGE組程組序組設(shè)置：U＝800V，I＝25／根，P＝200W，T＝4∶00?？翠宸铀{指示劑的位置，停止電泳，固定40min考馬斯亮藍染色50min，脫色1.5h。

1.5 圖像分析

運用D3000掃描儀掃描凝膠，Imagemaster 2D 蛋白分析軟件對，對每張電泳圖譜上尋找6 個標(biāo)定點作為匹配點，根據(jù)匹配點的位置對其他蛋白質(zhì)進行匹配，尋找差異點。蛋白質(zhì)分子的等電點和分子質(zhì)量根據(jù)IPG 膠條pH 標(biāo)識、Marker范圍和標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)用軟件進行計算。對照組骨骼肌的蛋白質(zhì)2－DE 代表圖譜作為參考膠進行軟件分析。

1.6 質(zhì)譜鑒定及特異蛋白質(zhì)分類

蛋白質(zhì)鑒定采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI－TOF MS）技術(shù)分析進行，特異蛋白信息經(jīng)NCBI Protein數(shù)據(jù)庫中進行查新，質(zhì)譜指紋數(shù)據(jù)通過Mas－cot搜索引擎進行查詢。根據(jù)物種來源、蛋白質(zhì)匹配率、肽段相對分子量等參數(shù)進行蛋白質(zhì)鑒定。檢索后，按照蛋白質(zhì)在損傷修復(fù)中可能作用將蛋白質(zhì)分為4 類，I代表線粒體酶系統(tǒng)及能量代謝相關(guān)蛋白，II代表參與細胞損傷修復(fù)蛋白，III代表骨骼肌組成的結(jié)構(gòu)蛋白，IV 代表其他功能蛋白。

2 研究結(jié)果

2.1 一次大強度離心運動和一周后重復(fù)運動即刻組蛋白質(zhì)組差異狀況

經(jīng)2－DE分離A0組和B0組蛋白質(zhì)后，對比發(fā)現(xiàn)A0和B0之間共有62個蛋白質(zhì)發(fā)生了變化，其中40 個蛋白質(zhì)在B0組表達量出現(xiàn)了下調(diào)，22 個蛋白質(zhì)在B0組表達量出現(xiàn)了上調(diào)。其中下調(diào)蛋白的表觀等電點主要集中在pH4～6，表觀分子量主要集中20～40 Ku 和50～60 Ku之間；表達量上調(diào)的蛋白質(zhì)的表觀等電點主要集中在pH5.5～6.5組之間，表觀分組子組量組主組要組集組中組在30～50Ku之間。

圖1 一次性大強度運動和一周重復(fù)運動后的即刻組大鼠股四頭肌雙向凝膠電泳圖譜Figure 1.Two－dimensional Gel Electrophoresis Image of One and Repeated Eccentric Exercise Group in Quadriceps Femoris immediately after Exercise

表1 A0－B0組質(zhì)譜鑒定的特異蛋白質(zhì)信息一覽表Tabel 1 Differente Expression Proteins in Quadriceps Femoris immediately after One and Repeated Eccentric Exercise

對表達量變化明顯的19個特異蛋白質(zhì)進行質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)，其中I類蛋白8個，只有異檸檬酸脫氫酶（三羧酸循環(huán)的限速酶）表達量上調(diào)，其余磷酸葡萄糖變位酶（糖酵解主要酶）、ATP 合成酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶、血色素結(jié)合蛋白等表達量均下調(diào)；II類蛋白8個，表達量下調(diào)的蛋白質(zhì)為血色素結(jié)合蛋白、胞內(nèi)氯離子通道蛋白、蛋白磷酸酶、結(jié)合珠蛋白前體泛素羧基末端水解酶等；III類蛋白3個，分別為胎球蛋白A、三重基序蛋白72、結(jié)構(gòu)域蛋白等；IV 類蛋白5個。

2.2 一次大強度離心運動和一周后重復(fù)運動后24h組蛋白質(zhì)組差異狀況

A24組和B24組蛋白質(zhì)表達譜分析，發(fā)現(xiàn)共有47 個蛋白質(zhì)發(fā)生了變化，其中8 個蛋白質(zhì)在B0組表達量出現(xiàn)了下調(diào)，39個蛋白質(zhì)在B0組表達量出現(xiàn)了上調(diào)，其中下調(diào)蛋白的表觀等電點主要集中在pH5.1～6.3，表觀分子量主要集中20～70Ku之間；表達量上調(diào)的蛋白質(zhì)的表觀等電點主要集中在pH4.2～7.0 之間，表觀分子量主要集中在25～106Ku之間。

圖2 一次性大強度運動和一周重復(fù)運動后的24h組大鼠股四頭肌雙向凝膠電泳圖譜Figure 2.Two－dimensional Gel Electrophoresis Image of One and Repeated Eccentric Exercise Group in Quadriceps Femoris at 24hafter Exercise

表2 A24－B24組質(zhì)譜鑒定的特異蛋白質(zhì)信息一覽表Table 2 Differente Expression Proteins in Quadriceps Femoris at 24hafter One and Repeated Eccentric Exercise

對表達量變化明顯的21個特異蛋白質(zhì)進行質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)，其中I類蛋白3個，并且相對表達量均出現(xiàn)上調(diào)，其中磷酸葡萄糖變位酶表達量上調(diào)5.1 倍，絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶表達量上調(diào)2倍，谷胱苷肽過氧化物酶表達量上調(diào)2.9倍；II類蛋白10 個，表達量上調(diào)的蛋白質(zhì)有8 個，分別是α－輔肌動蛋白－3、蛋白磷酸酶1調(diào)節(jié)亞基7、慢骨骼肌肌鈣蛋白、肌球蛋白輕鏈3、谷胱苷肽過氧化物酶、雙功能過氧化物酶等，表達量下調(diào)的2個蛋白質(zhì)為ATM 蛋白、胞內(nèi)氯離子通道蛋白等；III類蛋白6 個，分別為線粒體內(nèi)膜蛋白、肌球蛋白等；IV 類蛋白7個，表達量均出現(xiàn)上調(diào)。

2.3 一次大強度離心運動和一周后重復(fù)運動后48h組蛋白質(zhì)組差異狀況

圖3 一次性大強度運動和1周重復(fù)運動后的48h組大鼠股四頭肌雙向凝膠電泳圖譜Figure 3.Two－dimensional Gel Electrophoresis Image of One and Repeated Eccentric Exercise Group in Quadriceps Femoris at 48hafter Exercise

A48組和B48組蛋白質(zhì)表達譜分析，發(fā)現(xiàn)共有49 個蛋白質(zhì)表達量出現(xiàn)了變化，其中45 個蛋白質(zhì)在B48組表達量出現(xiàn)了下調(diào)，4 個蛋白質(zhì)在B48組表達量出現(xiàn)了上調(diào)。其中下調(diào)蛋白的表觀等電點主要集中在pH5.0～6.5，表觀分子量主要集中20～66Ku之間；表達量上調(diào)的蛋白質(zhì)的表觀等電點主要集中在pH5.9～6.6 之間，表觀分子量主要集中在27～60Ku之間。

表3 A48－B48組質(zhì)譜鑒定的特異蛋白質(zhì)信息一覽表Table 3 Differente Expression Proteins in Quadriceps Femoris at 48hafter One and Repeated Eccentric Exercise

對表達量變化明顯的16個特異蛋白質(zhì)進行質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)，其中I類蛋白8個，并且相對表達量上調(diào)的蛋白質(zhì)1個，為β－E1丙酮酸脫氫酶，表達量下調(diào)的蛋白質(zhì)7 個，分別為異檸檬酸脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、甘油－3 磷酸脫氫酶等；II類蛋白10 個，表達量均出現(xiàn)了顯著性下調(diào)，分別是Ⅱ型細胞骨架1角蛋白、硫酸軟骨素葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶、線粒體應(yīng)急蛋白－HSP70、硫酸軟骨素葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶、雙功能過氧化物酶等；III類蛋白1 個，表達量下調(diào)，為Ⅱ型細胞骨架1角蛋白。

2.4 一次大強度離心運動和一周后重復(fù)運動后72h組蛋白質(zhì)組差異狀況

A72組和B72組蛋白質(zhì)表達譜分析，發(fā)現(xiàn)共有46 個蛋白質(zhì)表達量出現(xiàn)了變化，其中42 個蛋白質(zhì)在B72組表達量出現(xiàn)了下調(diào)，4 個蛋白質(zhì)在B72組表達量出現(xiàn)了上調(diào)，其中下調(diào)蛋白的表觀等電點主要集中在pH4.8～7.0，表觀分子量主要集中在20.1～97Ku之間；表達量上調(diào)的蛋白質(zhì)的表觀等電點主要集中在pH4.9～6.5之間，表觀分子量主要集中在35～59Ku之間。

圖4 一次性大強度運動和一周重復(fù)運動后的72h組大鼠股四頭肌雙向凝膠電泳圖譜Figure 4 Two－dimensional Gel Electrophoresis Image of One and Repeated Eccentric Exercise Group in Quadriceps Femoris at 72hafter Exercise

表4 A72－B72組質(zhì)譜鑒定的特異蛋白質(zhì)信息一覽表Table 4 Differente Expression Proteins in Quadriceps Femoris at 72hafter One and Repeated Eccentric Exercise

對表達量變化明顯的23個特異蛋白質(zhì)進行質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)，有22個蛋白表達量出現(xiàn)了顯著下調(diào)，1 個蛋白表達量顯著上調(diào)，1個蛋白質(zhì)點消失；其中I類蛋白9 個，表達量均顯著下調(diào)，其中丙酮酸脫氫酶E1 部分β亞基未檢測到，其余M－型肌酸激酶、ADP 核糖基轉(zhuǎn)化因子蛋白、6－磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶、糖原磷酸化酶、NADH 輔酶氧化還原酶、谷胱苷肽過氧化物酶1、磷酸酶2C 蛋白、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶等表達量均下降了2.0～5.2倍之間；II類蛋白8個，其中Ⅱ型細胞骨架1 角蛋白表達量上調(diào)2.4倍，其余蛋白質(zhì)表達量均出現(xiàn)了顯著性下調(diào)，分別是泛素羧基末端水解酶、免疫球蛋白λ鏈、谷胱苷肽過氧化物酶、慢骨骼肌肌鈣蛋白、線粒體應(yīng)急蛋白－70、前列腺素還原酶2、β－烯醇化酶等表達量下降1.8～5.5 倍之間；III類蛋白7個，分別為39S核糖體蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐地蛋白29、慢骨骼肌肌鈣蛋白、Ⅱ型細胞骨架1角蛋白、肌球蛋白1／3 輕鏈等；IV 類 蛋 白5個。

2.5 一次大強度離心運動和一周后重復(fù)運動后168h組蛋白質(zhì)組差異狀況

圖5 一次性大強度運動和一周重復(fù)運動后的168h組大鼠股四頭肌雙向凝膠電泳圖譜Figure 5.Two－dimensional Gel Electrophoresis Image of One and Repeated Eccentric Exercise Group in Quadriceps Femoris at 168hafter Exercise

表5 A168－B168組質(zhì)譜鑒定的特異蛋白質(zhì)信息一覽表Table 3 Differente Expression Proteins in Quadriceps Femoris at 168hafter One and Repeated Eccentric Exercise

A168組和B168組蛋白質(zhì)表達譜分析，發(fā)現(xiàn)共有26個蛋白質(zhì)表達量出現(xiàn)了變化，其中4 個蛋白質(zhì)在B168組表達量出現(xiàn)了下調(diào)，22個蛋白質(zhì)在B168組表達量出現(xiàn)了上調(diào)，其中下調(diào)蛋白的表觀等電點主要集中在pH6.1～7.0，表觀分子量主要集中在41.3～62.0Ku之間；表達量上調(diào)的蛋白質(zhì)的表觀等電點主要集中在pH4.0～6.8 之間，表觀分子量主要集中在20.1～60.8Ku之間。對表達量變化明顯的12個特異蛋白質(zhì)進行質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)，有3個蛋白表達量出現(xiàn)了顯著下調(diào)，8 個蛋白表達量顯著上調(diào)。I類蛋白5個，其中2個表達量均顯著下調(diào)，其中NADH 脫氫酶、丙酮酸激酶同功酶表達量分別下降了2.3倍和1.9 倍；3 個蛋白質(zhì)表達量顯著上調(diào)，其中過氧化物酶－6、磷酸丙糖異構(gòu)酶、血色素結(jié)合蛋白表達量分別上調(diào)了1.8倍、2.8組倍組和2.0組倍；II類組蛋組白2組個，其組中組表達量均出現(xiàn)了顯著性上調(diào)，分別是NDRG2蛋白、蛋白酶體亞 基β－6，表達組量組分組別組上組調(diào)2.5組倍組和4.7組倍；III類組蛋組白3個，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐地蛋白29未新檢測到的蛋白，其余線粒體內(nèi)膜蛋白表達量下降了1.7倍，血色素結(jié)合蛋白表達量上升了2.0倍等；IV 類蛋白2個。

2.6 一次大強度離心運動和1周后重復(fù)運動后特異蛋白質(zhì)表達情況匯總

圖6 一次大強度離心運動和1周后重復(fù)運動后特異蛋白質(zhì)分類表達情況示意圖Figure 6.The Kind of Different Expression Protein in Quadriceps Femoris after One and Repeated Eccentric Exercise

從圖6可知，I類蛋白表達在重復(fù)運動組中主要表現(xiàn)為下調(diào)為主，特別是在運動后即刻至運動后72h 之間，A組中I類蛋白表達量上調(diào)的蛋白數(shù)目較B組有明顯增加，而B組與A組比較，特異性蛋白主要以表達量下調(diào)的蛋白質(zhì)為主。II類蛋白表達在0～72h之間與I類蛋白表達趨勢類似，在B組中主要以下調(diào)為主。B組中III類蛋白表達在0～24h內(nèi)上調(diào)和下調(diào)數(shù)目無顯著差異，在72h時，下調(diào)數(shù)目明顯多于上調(diào)蛋白數(shù)目。IV 類蛋白在B組中則表現(xiàn)為上調(diào)、下調(diào)交替出現(xiàn)。

通過對A組和B組特異蛋白質(zhì)在0～168h內(nèi)表達差異出現(xiàn)頻次的比較，發(fā)現(xiàn)共有18 個蛋白質(zhì)出現(xiàn)2 次以上表達量變化，其中角蛋白、血色素結(jié)合蛋白、磷酸丙糖異構(gòu)酶等3個蛋白質(zhì)表達量出現(xiàn)了3 次顯著性變化，說明在一次大強度離心運動及重復(fù)運動后導(dǎo)致的微損傷修復(fù)過程中，上述蛋白屬于表達相對活躍的蛋白質(zhì)。在上述18 個特異性蛋白中，I類蛋白6個，II類蛋白12 個，III類蛋白7個。

3 討論

下坡跑過程中，由于受試者本身需要抵抗身體的重量進行運動，從而使肌肉組織承受一定負荷而進行離心收縮，易發(fā)于骨骼肌離心運動時相造成骨骼肌微損傷，這也是比較典型的骨骼肌損傷病理模型［3，4］。一次離心運動后，骨骼肌損傷具有延遲現(xiàn)象，損傷在24h后出現(xiàn)明顯結(jié)構(gòu)變化，運動后7d后損傷骨骼肌超微結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)［12］。本研究組前期研究發(fā)現(xiàn)，重復(fù)運動較一次大強度離心運動促進肌纖維再生及骨骼肌重建，特別是48～168h內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)與數(shù)量恢復(fù)速度加快［1］，說明在一次大強度離心運動可能引起骨骼肌線粒體出現(xiàn)融合－分裂適應(yīng)機制，在重復(fù)運動過程中線粒體的結(jié)構(gòu)和數(shù)量較第一次運動后恢復(fù)速度明顯加快，可能促進受損組織有氧代謝能力提高，從而有利于受損組織再生。前人通過對急性力竭運動后大鼠骨骼肌蛋白質(zhì)組差異性表達發(fā)現(xiàn)，大鼠股四頭肌蛋白質(zhì)在大強度跑臺運動后產(chǎn)生了明顯的蛋白質(zhì)新增和缺失（質(zhì)）及表達量上調(diào)和下調(diào)（量）的變化，但是，該研究未對特異性蛋白進行鑒定。另外，短期連續(xù)的離心訓(xùn)練后，骨骼肌中Calpain 和Ubiquitin 的動態(tài)變化幾乎與骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化相一致［2］。因此，損傷結(jié)構(gòu)變化與蛋白質(zhì)變化之間存在一定關(guān)聯(lián)。本研究通過對一次大強度運動及一周后重復(fù)運動后骨骼肌微損傷恢復(fù)過程中骨骼肌蛋白質(zhì)組變異，分析一次大強度運動及重復(fù)運動后損傷修復(fù)過程中起作用的特異蛋白質(zhì)。

表6 特異性蛋白表達頻次及表達時間對應(yīng)一覽表Table 6 The Expression Frequency and Time of Specific Protein

按照功能對特異蛋白質(zhì)進行分類，發(fā)現(xiàn)損傷修復(fù)過程中能量代謝相關(guān)蛋白（I類）屬于表達活躍的一組蛋白。其中參與有氧代謝的主要酶分別是異檸檬酸脫氫酶、磷酸葡萄糖變位酶、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶、血色素結(jié)合蛋白，參與糖酵解過程的有丙酮酸脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶。異檸檬酸脫氫酶主要參與三羧酸循環(huán)，是三羧酸循環(huán)的限速酶，負責(zé)催化異檸檬酸氧化脫羧成α－酮戊二酸，并將氧化型NAD 還原成NADH，決定著生物體有氧氧化功能的速率。磷酸葡萄糖變位酶催化葡萄糖－1－磷酸鹽和葡萄糖－6－磷酸鹽相互轉(zhuǎn)化。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶（NADH 脫氫酶）是線粒體電子傳遞鏈中第一個酶，也是電子傳遞鏈中含量最多且最復(fù)雜的一種酶。血色素結(jié)合蛋白存在于人血清中的高豐度β1 糖蛋白，對血紅素有高親和力，對于人體利用氧的能力起關(guān)鍵作用。丙酮酸脫氫酶是丙酮酸脫氫酶復(fù)合體中的主要組成成分，該復(fù)合體是生物體內(nèi)催化丙酮酸轉(zhuǎn)變成乙酰輔酶A 之反應(yīng)的3種酶及5種輔酶的組合，所參與的反應(yīng)名稱是丙酮酸脫羧，是連結(jié)糖酵解（最終產(chǎn)物為丙酮酸）與檸檬酸循環(huán)（起始反應(yīng)物為乙酰輔酶A）的一連串化學(xué)反應(yīng)。磷酸丙糖異構(gòu)酶能快速催化丙糖磷酸異構(gòu)體在二羥丙酮磷酸和D－甘油醛－3－磷酸之間的可逆轉(zhuǎn)化，在糖酵解的過程具有很重要的作用。同時，表6中顯示I類蛋白主要出現(xiàn)在損傷修復(fù)后72h之內(nèi)，與前期本研究組對損傷后超微結(jié)構(gòu)變化情況規(guī)律基本一致，表明損傷后72h 內(nèi)是損傷細胞能量供應(yīng)逐漸恢復(fù)的階段［9，14］。因此，在一次大強度運動及重復(fù)運動過程中，受損組織有氧代謝及糖酵解過程的一些關(guān)鍵酶類活性變化比較顯著，表明微損傷修復(fù)過程中能量代謝恢復(fù)速率可能是影響骨骼肌損傷修復(fù)的重要因素。

II類蛋白主要參與細胞損傷修復(fù)。在運動后即刻，B組II類蛋白除肌球蛋白可能因A組運動后一周內(nèi)尚未完全恢復(fù)至初始值導(dǎo)致重復(fù)運動后含量較高之外，其余以下調(diào)為主，反映了重復(fù)運動即刻誘導(dǎo)的損傷程度明顯比第一次大強度運動輕。胎球蛋白A 在0h 表達量出現(xiàn)明顯變化，可能是因為胎球蛋白具有調(diào)理素作用，可以促進精胺介導(dǎo)巨噬細胞失活，下調(diào)致炎因子的釋放，減輕氧化應(yīng)激損傷，同時胎球蛋白具有促進巨噬細胞對炎癥細胞的胞吞作用［5］；至運動后24h，B組參與細胞損傷修復(fù)的蛋白質(zhì)較A組表達上調(diào)數(shù)目增多，說明在重復(fù)運動后24h后是損傷細胞重要修復(fù)期；至運動后48h，B組II類蛋白表達以下調(diào)為主，而A組類蛋白表達以上調(diào)為主，表明一次大強度運動后受損細胞修復(fù)主要從48h 后開始，而重復(fù)運動后則修復(fù)期為24h～48h之間進行。在重復(fù)運動后受損細胞修復(fù)過程中，主要有以下蛋白表達活躍：泛素羧基末端水解酶屬于泛素蛋白水解酶復(fù)合體中重要酶類，能催化水解泛素羧基末端多肽鏈連接，起到去泛素化對蛋白質(zhì)降解進行反向調(diào)節(jié)，影響細胞的代謝、分化、增殖、凋亡調(diào)控蛋白等。一次大強度運動后，泛素化蛋白含量增加，泛素蛋白酶體途徑活性增強，加速骨骼肌收縮蛋白降解［2－3］。重復(fù)運動后0h和72h檢測到泛素羧基末端水解酶含量明顯下降，表明重復(fù)運動造成的骨骼肌收縮蛋白水解程度下降［11］。谷胱苷肽過氧化物酶1、雙功能過氧化物酶為自由基清除酶類，在重復(fù)運動后0h 表達量上升，并分別在48h和24h后表達量下降，說明重復(fù)運動后即刻骨骼肌自由基清除能力加強。

TRIM72在骨骼肌中特定地表達，在細胞膜的修復(fù)中有很重要的作用，修復(fù)機制是在受傷部位進行成核的組裝，特異性結(jié)合磷脂酰絲氨酸，作為一個氧化傳感器，在損傷的膜上，進入細胞外的氧化環(huán)境在損傷的部位引起二硫鍵生成和同源寡聚化。這寡聚化為損傷部位募集包含TRIM72的泡囊而作為一個成核位置，引起膜補丁的生成。肌球蛋白是肌原纖維粗絲的組成單位，在重復(fù)運動后即刻表達量上升2.4倍，可能是因為重復(fù)運動募集更多骨骼肌參與離心運動，從而使更多肌球蛋白得以釋放［13，15］；至72h，肌球蛋白表達量低于A組2 倍，可能是隨著B組肌纖維重建發(fā)生在24～48h間，至72h肌纖維重建較A組完整導(dǎo)致［1］。線粒體內(nèi)膜蛋白表達在B組重復(fù)運動后24h和72h顯著變化，并且其變化早于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐地蛋白的變化，可能是因為線粒體是骨骼肌損傷修復(fù)階段較早恢復(fù)的亞細胞器。

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