蔡夢昕，張娟娟，史秀超，田振軍

Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China.

心肌梗死（Myocardial Infarction，MI）是導(dǎo)致人類死亡的主要心血管疾病之一。MI可導(dǎo)致梗死區(qū)發(fā)生替代性纖維化，形成瘢痕組織，引起惡性心室重塑，心功能紊亂［35，42］。促進(jìn)MI后心肌細(xì)胞的再生，對于改善心肌結(jié)構(gòu)重塑，提升心功能意義重大。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為，心肌細(xì)胞屬于終末分化細(xì)胞，損傷后不能再生。近年來發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞存在再生能力，正常生理和病理情況下成體心肌細(xì)胞均存組在組增組殖組現(xiàn)組象［8，9，41］，其組緩組慢組更組新組隨組年組齡組增組長組而組下組降［9］。Kajstura等發(fā)現(xiàn)，每100萬個心肌細(xì)胞中有14個處于有絲分裂期，而缺血性心肌中處于有絲分裂期的數(shù)量增加了近10倍［21］。Beltrami等同樣發(fā)現(xiàn)，MI區(qū)周圍組織存在新生的心肌細(xì)胞，但數(shù)目有限，不能滿足心肌修復(fù)的需要［8］。隨著干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)證實內(nèi)源性心臟干／祖細(xì)胞（endogenous Cardiac Stem Cells，eCSCs）、骨髓來源的干細(xì)胞等成體干細(xì)胞，可誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，為組心組肌組修組復(fù)組提組供組了組細(xì)組胞組來組源［7，33，46，48］。目組前組針組對MI后心肌修復(fù)的研究主要包括心肌細(xì)胞周期的重新啟動、移植心肌細(xì)胞或干細(xì)胞遷移至損傷部位并刺激分化為心肌細(xì)胞，以及動員內(nèi)源性成體干細(xì)胞的歸巢、增殖和分化。由于心肌細(xì)胞本身再生能力有限，而移植的細(xì)胞又存在成瘤性和排異性等風(fēng)險，尋求安全有效的促進(jìn)心肌細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期，以及動員內(nèi)源性成體干細(xì)胞的方法和途徑具有重大意義。

研究表明，MI后給予粒細(xì)胞集落刺激因子（Granulocyte－Colony Stimulating Factor，G－CSF）可改善心功能和左心室重塑，縮小梗死面積［30，34］。G－CSF 是骨髓中多種干細(xì)胞強(qiáng)有力的動員劑，可增加外周血中干細(xì)胞的數(shù)量并移到受損部位，誘導(dǎo)心肌再生［16，32］。研究發(fā)現(xiàn)，骨髓干細(xì)胞的歸巢與基質(zhì)細(xì)胞衍生因子－1（Stromal Cell－derived Factor，SDF－1）及其受體CXCR4 信號密切相關(guān)，并通過激活GATA－4和Nkx2.5 等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)啟動心肌化的發(fā)生［4，40］。近期研究發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動誘導(dǎo)心臟生理性肥大的同時，伴隨有組心組肌組細(xì)組胞組增組殖組的組發(fā)組生［2，11，49］。有組氧組運(yùn)組動組可組顯著提高心肌中生長因子的表達(dá)，促進(jìn)c－kit＋eCSCs激活和分化，進(jìn)而促進(jìn)心肌再生［49］。近年來發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動同樣能夠有效提升MI患者心功能［13，17］，適度有氧運(yùn)動可抑制心肌細(xì)胞凋亡［15］，縮小梗死面積，減輕膠原過度沉積和纖維化現(xiàn)象，減緩梗死后的心室重塑，改善左心室功能［52］。有研究提出，運(yùn)動可激活干細(xì)胞活性，參與心血管和骨骼肌的再生過程［47］。然而運(yùn)動提升MI心臟功能是否與心肌細(xì)胞再生有關(guān)，目前尚無文獻(xiàn)報道。因此推測，有氧運(yùn)動促進(jìn)心肌損傷的修復(fù)可能與干細(xì)胞動員激活有關(guān)。運(yùn)動和G－CSF干預(yù)能否更有效地動員骨髓干細(xì)胞歸巢，修復(fù)心肌損傷，提升心功能需要實驗證實。本研究通過建立大鼠MI模型，檢測有氧運(yùn)動和G－CSF干預(yù)對大鼠心功能、心肌組織結(jié)構(gòu)、心肌細(xì)胞增殖標(biāo)記蛋白、干細(xì)胞趨化相關(guān)因子和干細(xì)胞表面抗原蛋白的表達(dá)，探討其可能機(jī)制，為MI患者的臨床康復(fù)手段與方法的篩選提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

3月齡雄性Sprague－Dawley大鼠85只（購于西安交通大學(xué)實驗動物管理中心，動物質(zhì)量合格證號：陜醫(yī)動證字08－004），體重180～220g，分籠飼養(yǎng)，每籠6只，國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物干燥飼料喂養(yǎng)，自由飲食。動物室內(nèi)溫度20℃～29℃，相對濕度40%～50%。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，進(jìn)行左冠狀動脈前降支（LAD）結(jié)扎手術(shù)，術(shù)后存活75只大鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組（Sham組）、心梗組（MI組）、心梗＋運(yùn)動組（ME組）、心梗＋動員劑組（MG組）和心梗＋動員劑＋運(yùn)動組（MGE組）。

1.2 主要儀器和試劑

主要儀器：ALC－V8組動組物組呼吸機(jī)、PowerLab／8s生組理組信號采集處理系統(tǒng)、LEICA－RM2126 切片機(jī)、BM－Ⅱ型病理組織包埋機(jī)、生物組織攤烤片機(jī)、BX51 奧林巴斯光學(xué)顯微鏡、尼康熒光顯微鏡、Bio－Rad電泳儀和轉(zhuǎn)移槽、凝膠成像系組統(tǒng)、PCR組儀組等。

主要試組劑：Tween 20、SABC組試組劑組盒、DAB組顯組色組試組劑組盒（武漢博士德）、兔抗多克隆抗體Ki－67、CD29、CD44、SDF－1、CXCR4、MCP－1、VLA－4（北組京組博組奧組森）和c－kit（美 國Santa Cruz）、小鼠單克隆抗體PCNA（Biotrigen）和GATA－4（美國Abcam）、Trizol（加拿大Bio Basic Inc）、Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（德國Fermentas）、PCR 引物（上海生工）。

1.3 MI大鼠模型制備

5%戊巴比妥鈉溶液（30 mg／kg）腹腔注射麻醉，采用呼吸機(jī)連接大鼠呼吸面罩輔助呼吸，待大鼠呼吸平穩(wěn)后，開胸暴露心臟，在左心耳和肺動脈圓錐間下緣2 mm 處結(jié)扎左冠狀動脈前降支，進(jìn)針深度為0.3～0.5 mm，同時監(jiān)測心電圖和心肌顏色變化。以心電圖ST 段弓背抬高，出現(xiàn)病理性Q 波或T 波倒置為結(jié)扎成功標(biāo)志，之后逐層縫合。假心梗組只開胸穿線，不結(jié)扎。

1.4 有氧運(yùn)動方案和G－CSF給藥方法

ME 和MGE組術(shù)后1周進(jìn)行跑臺有氧運(yùn)動。第1周為適應(yīng)性運(yùn)動，以10m／min起始速度運(yùn)動10min后，逐漸遞增至16 m／min，運(yùn)動總時間為50 min；正式運(yùn)動時，以10m／min的起始速度運(yùn)動5min后，以2m／min逐漸遞增至16m／min，保持該速度運(yùn)動至50min，5d／周×8周［52］。MG 和MGE組手術(shù)3h后，給予生理鹽水稀釋的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（rhG－CSF）皮下注射，劑量為10μg／kg／d×5d，其余3組大鼠經(jīng)皮下注射等量生理鹽水［1］。

1.5 心功能測定

采用血流動力學(xué)方法測定大鼠心功能。8周運(yùn)動結(jié)束后次日，麻醉并稱重，經(jīng)右頸總動脈逆行插管至左心室，以多導(dǎo)生理記錄儀測試左室收縮壓（Left Ventricular Systolic Pressure，LVSP）、左室舒張末壓（Left Ventricular End－Diastolic Pressure，LVEDP）、左室壓力最大 上升速 率（＋dp／dtmax）和最大下降速率（－dp／dtmax）。

1.6 TTC 染色與樣本處理

麻醉后開胸摘取心臟。每組隨機(jī)取3只進(jìn)行TTC 染色：生理鹽水沖洗后置于液氮中速凍，10 min后取出，切成1～2mm 薄片，1%2，3，5－氯化三苯四氮唑溶液（TTC）室溫孵育30min。數(shù)碼相機(jī)拍照，統(tǒng)計梗死區(qū)（灰白色）與非梗死區(qū)（紅色）面積。

將進(jìn)行心肌組織Masson染色和免疫組織化學(xué)實驗的標(biāo)本置于10%中性甲醛溶液固定24h后，常規(guī)石蠟包埋，5μm 連續(xù)切片。將用于Western Blot和RT－PCR 實驗的標(biāo)本入液氮24h后，移至－80℃低溫冰存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 免疫組織化學(xué)實驗

實驗嚴(yán)格按照SABC 免疫組化染色試劑盒說明書進(jìn)行。切片脫蠟至水，PBS清洗，3% H2O2浸泡10min，微波抗原修復(fù)，PBS清洗后滴加正常山羊血清封閉液（37℃，30組min），孵組育組一組抗（4℃過組夜），其組中PCNA、Ki－67、CD29 和CD44 稀釋比例為1∶80，c－kit為1∶100，PBS清洗，孵育二抗（37℃，30 min），PBS組清 洗，孵育SABC組復(fù)合組物（37℃，30min），PBS清洗，DAB顯色，蒸餾水洗滌終止反應(yīng)，蘇木精復(fù)染、封片、鏡檢。設(shè)置空白對照（PBS 取代一抗和二抗）和陰性對照（PBS取代一抗）。

1.8 Western Blot實驗

8%～12% Tris－甘氨酸SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉后孵育干細(xì)胞表面抗原c－kit、CD29 和CD44（濃度分別為1∶500、1∶200 和1∶200），干細(xì)胞趨化相關(guān)蛋白SDF－1、CXCR4、VLA－4和MCP－1（濃度分別為1∶200、1∶300、1∶500 和1∶500），細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子GATA－4蛋白（濃度為1∶2 000），4℃過夜，孵育二抗（室溫，30min），洗膜后ECL 發(fā)光，內(nèi)參照為GAPDH。

1.9 RT－PCR 實 驗

Trizol試劑提取梗死周邊區(qū)心肌組織總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR 反應(yīng)試劑盒說明書操作步驟，獲得cDNA 產(chǎn) 物，并組進(jìn)組行PCR組反組應(yīng)，GAPDH組為組內(nèi)組部組參組照。

GATA－4（337bp）上組游組引組物：5’－AAGACGCCAGCAGGTCCTGCTGGT－3’，下組游組引組物：5’－CGCGGTGATTATGTCCCCATGACT－3’；

教師不但要在教學(xué)實踐中對學(xué)生學(xué)習(xí)情況進(jìn)行監(jiān)管和引導(dǎo)，同時在發(fā)布各個任務(wù)之前，應(yīng)該設(shè)定對應(yīng)任務(wù)規(guī)劃目標(biāo)。在任務(wù)設(shè)計完成以后，需要開展項目分析及課程結(jié)構(gòu)分析等工作。探究教學(xué)提綱以及課程框架，獲取各個知識模板教學(xué)框架。同時，將各個項目任務(wù)劃分為多個模塊，同時各個模塊均要結(jié)合對應(yīng)知識點將其劃分成多個部分教學(xué)內(nèi)容。教師可以根據(jù)教學(xué)要求和內(nèi)容實現(xiàn)對應(yīng)教學(xué)任務(wù)的設(shè)計，將各個學(xué)習(xí)知識隱藏在各個任務(wù)中，讓學(xué)生在落實各個任務(wù)時實現(xiàn)知識點的科學(xué)應(yīng)用，提升學(xué)習(xí)能力[4]。此外，結(jié)合項目開發(fā)模板及各個學(xué)生學(xué)習(xí)特性進(jìn)行小組分配，同時下發(fā)對應(yīng)的學(xué)習(xí)任務(wù)，給實施環(huán)節(jié)做好準(zhǔn)備。

GAPDH（595bp）上組游組引組物：5’－CAGTGCCAGCCTCGTCTCAT－3’，下組游組引組物：5’－AGGGGCCATCCACAGTCTTC－3’。

擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性1 min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共循環(huán)35次。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，100V 電壓電泳25min，凝膠成像系統(tǒng)檢測。

1.10 圖像、數(shù)據(jù)采集與分析

顯微鏡圖像經(jīng)Image－Pro Plus 5.1 軟件采集并分析；Western Blot膠片采用Image Quant TL 軟件進(jìn)行分析，所得數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 5.0Demo軟件轉(zhuǎn)換作圖。所有數(shù)據(jù)均組采組用SPSS組17.0組軟組件組包組進(jìn)組行組處組理，采組用One－Way組ANOVA組進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗結(jié)果均以）表示，組間顯著性差異水平為P＜0.05和P＜0.01。

2 實驗結(jié)果

2.1 MI模型大鼠存活率和心功能測定結(jié)果

MI術(shù)后75只大鼠，經(jīng)8周實驗干預(yù)后，存活為100%。心功能測試結(jié)果表明，8周后，與Sham組比較，MI組LVEDP顯著升高（P＜0.01），LVSP 和±dp／dtmax顯著降低（P＜0.01）；與MI組 比 較，ME、MG 和MGE組LVEDP顯著下降（P＜0.01），LVSP顯著升高（P＜0.01），±dp／dtmax顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；與ME 和MG組比較，MGE組LVEDP下降更為顯著（P＜0.05，圖1）。提示，MI嚴(yán)重?fù)p害了心功能，有氧運(yùn)動或G－CSF可有效改善心功能，且聯(lián)合干預(yù)效果優(yōu)于單一因素。

2.2 TTC 染色結(jié)果

TTC染色后，紅色為正常心肌組織，白色為壞死心肌組織。梗死面積百分比＝梗死面積／總面積×100%。與對照組比較，MI組梗死區(qū)明顯，梗死面積百分比為27.33±4.62%；與MI組比較，ME、MG 和MGE組梗死面積明顯縮小，梗死面積百分比分別為18.07±2.41%（P＜0.05）、16.68±5.20%（P＜0.05）和9.23±2.61%（P＜0.01），且聯(lián)合干預(yù)組梗死面積明顯小于單純干預(yù)組（P＜0.05）（圖2）。

圖1 本研究大鼠心功能測試結(jié)果示意圖Figure 1.Changes of Different Index of Hemodynamic in Rats

圖2 本研究大鼠梗死面積變化示意圖Figure 2.Changes of Infarct Size in Rats

2.3 Masson染色結(jié)果

Masson染色結(jié)果顯示，膠原纖維呈藍(lán)色，心肌細(xì)胞呈紅色、細(xì)胞核呈藍(lán)紫色。正常心肌組織膠原纖維染色清晰，區(qū)分明顯，細(xì)胞排列整齊，膠原纖維分布正常；MI組可見典型的替代性纖維化，膠原纖維過度增生，并向梗死邊緣區(qū)和非梗死區(qū)延伸；ME、MG 和MGE組梗死區(qū)膠原纖維較MI組減少，纖維化程度降低，且MGE組效果更為明顯（圖3A）。

圖3 本研究心臟組織Masson染色、Ki－67和PCNA蛋白表達(dá)的免疫組化結(jié)果示意圖Figure 3.Masson Staining and Immunohistochemical Results of Ki－67and PCNA in Rat Myocardium

2.4 有氧運(yùn)動和／或G－CSF干預(yù)對心肌細(xì)胞增殖的影響

免疫組化結(jié)果顯示，正常心肌組織PCNA 和Ki－67陽性顆粒主要分布于心肌細(xì)胞核，表達(dá)很少；與Sham組比較，MI組梗死區(qū)及其邊緣，可見少量PCNA 和Ki－67蛋白表達(dá)；與MI組比較，ME、MG 和MGE組表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；且與ME和MG組相比，MGE組表達(dá)顯著升高（P＜0.05），（圖3B～D）。提示，MI后的損傷微環(huán)境可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，有氧運(yùn)動或G－CSF干預(yù)可顯著誘導(dǎo)心肌細(xì)胞周期的啟動，促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖，且二者雙重干預(yù)效果更為顯著。

2.5 有氧運(yùn)動和／或G－CSF 干預(yù)對心肌組織干細(xì)胞表面抗原表達(dá)的影響

2.6 有氧運(yùn)動和／或G－CSF干預(yù)對心肌組織干細(xì)胞趨化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western Blot結(jié)果顯示，與對照組比較，MI組VLA－4蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.01），SDF－1、CXCR4 和MCP－1蛋白表達(dá)無顯著性差異；與MI組比較，ME、MG 和MGE組VLA－4和CXCR4蛋白表達(dá)增加（P＜0.05，P＜0.01），SDF－1和MCP－1無顯著性差異，MGE組CXCR4表達(dá)顯著高于ME組（P＜0.05，圖5）。

2.7 有氧運(yùn)動和／或G－CSF 干預(yù)對心肌組織轉(zhuǎn)錄因子GATA 4表達(dá)的影響

與對照組比較，MI組GATA－4 mRNA 和蛋白表達(dá)顯著下降（P＜0.01，P＜0.05）；與MI組比較，ME 和MG組GATA－4 mRNA 和蛋白均有所上調(diào)，但無顯著差異；MGE組GATA－4mRNA 和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01），且與單純干預(yù)組比較，均顯著上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01，圖6）。

3 分析與討論

3.1 有氧運(yùn)動和／或G－CSF 干預(yù)可改善MI大鼠心功能和心肌組織結(jié)構(gòu)

MI早期，梗死區(qū)和非梗死區(qū)心肌細(xì)胞代償性肥大，心肌組織出現(xiàn)良性重塑現(xiàn)象，穩(wěn)定心功能。隨著病理進(jìn)程的發(fā)展，心肌細(xì)胞大量丟失，成纖維細(xì)胞異常增生，膠原合成增加，尤其是Ⅰ型膠原大量沉積，心臟惡性重塑嚴(yán)重，最終可導(dǎo)致代謝失常及充血性心力衰竭。MI后改善心肌組織的惡性重塑和提升心功能是臨床治療的關(guān)鍵。眾所周知，適宜的運(yùn)動鍛煉能夠改善正常生理情況下的心臟功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)。近年來，運(yùn)動訓(xùn)練已被認(rèn)為是一種重要的心血管疾病預(yù)防組和組康組復(fù)組的組手組段［6，39，45］。實組驗組證組實，適組宜組的組運(yùn)組動訓(xùn)練可有效提升MI后的心功能［24］。運(yùn)動訓(xùn)練可改善左心室重塑現(xiàn)象，且MI后訓(xùn)練開始時間越早（MI后第1周），改善效果越顯著［20］。

圖5 本研究大鼠心臟組織SDF－1、CXCR4、VLA－4和MCP－1蛋白表達(dá)結(jié)果示意圖Figure 5.Results of Protein Expression of SDF－1，CXCR4，VLA－4and MCP－1in Rat Myocardium

圖6 本研究大鼠心肌組織中GATA4蛋白和mRNA表達(dá)結(jié)果示意圖Figure 6.Results of Protein and mRNA Expression of GATA4in Rat Myocardium

隨著干細(xì)胞理論與技術(shù)的發(fā)展，已為MI后的細(xì)胞治療開辟了新的途徑。有文獻(xiàn)報道，G－CSF 單獨使用或聯(lián)合SCF使用均可顯著提高M(jìn)I后的心功能［23］。本研究實驗結(jié)果證實，MI后1周進(jìn)行有氧訓(xùn)練和G－CSF干預(yù)，大鼠心肌梗死面積減小，心臟惡性重塑得到改善，LVSP 和±dp／dtmax顯著升高，LVEDP 降低，表明MI早期進(jìn)行有氧訓(xùn)練和G－CSF干預(yù)，顯著提升心功能，且發(fā)現(xiàn)二者聯(lián)合干預(yù)效果優(yōu)于單一因素。

3.2 有氧運(yùn)動和／或G－CSF 干預(yù)可促進(jìn)MI心臟的心肌細(xì)胞增殖

MI后心肌重塑過程復(fù)雜，心肌實質(zhì)和間質(zhì)成分比例改變，可直接影響心功能的穩(wěn)定。雖然臨床認(rèn)為，MI后瘢痕組織的薄厚與心臟室壁瘤的發(fā)生率高度相關(guān)，但過度的瘢痕組織會導(dǎo)致心室順應(yīng)性降低，嚴(yán)重影響心臟的舒縮能力，而心肌實質(zhì)成分中的功能性心肌細(xì)胞數(shù)目增加，對于心肌組織結(jié)構(gòu)完整和心功能提升意義重大。

傳統(tǒng)觀點認(rèn)為，心肌細(xì)胞在胚胎期和新生期具有增殖能力［36］，成體后心肌細(xì)胞即退出細(xì)胞周期。晚近研究表明，成組年組哺組乳組動組物組心組臟組具組有組再組生組能組力［7，9，22］，但組再組生組能組力組非常有限，不能滿足大面積心肌損傷后的修復(fù)。目前，關(guān)于心肌細(xì)胞再生的來源問題及其激活因素與機(jī)制的研究備受關(guān)注。Bostrom 和Waring等研究發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動可引起心肌細(xì)胞的生理性肥大，同時可促進(jìn)心肌細(xì)胞PCNA 和Ki－67的表達(dá)及Brdu標(biāo)記的心肌細(xì)胞數(shù)目的增多，促進(jìn)心肌細(xì)胞的有絲分裂［11，49］，而運(yùn)動與病理性心臟心肌細(xì)胞增殖的研究，目前尚無文獻(xiàn)報道。本研究通過對MI心臟心肌細(xì)胞PCNA 和Ki－67 的實驗觀察與分析，發(fā)現(xiàn)MI大鼠心臟存在心肌細(xì)胞增殖現(xiàn)象，可能與心肌損傷微環(huán)境的誘導(dǎo)有關(guān)；有氧運(yùn)動可顯著上調(diào)心肌組織PCNA 和Ki－67 的表達(dá)，表明有氧運(yùn)動可有效促進(jìn)MI心臟的心肌細(xì)胞增殖。G－CSF可有效動員干細(xì)胞歸巢于心梗部位，也可直接作用于心肌組細(xì)組胞，產(chǎn)組生組保組護(hù)組效組應(yīng)［18，19］。本組研組究組結(jié)果組發(fā)組現(xiàn)，GCSF可促進(jìn)MI大鼠心臟的心肌細(xì)胞增殖，且有氧運(yùn)動和G－CSF雙重干預(yù)顯著優(yōu)于單純干預(yù)的效果。

3.3 有氧運(yùn)動和／或G－CSF 干預(yù)可促進(jìn)干細(xì)胞歸巢與分化

目前研究認(rèn)為，具有增殖潛能的心肌細(xì)胞來源主要有以下4種：一是近期報道的成體心肌細(xì)胞［38］，具有收縮功能的單核心肌細(xì)胞，可通過誘導(dǎo)心肌細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期，促進(jìn)心組肌組細(xì)組胞組增組殖［10，25，54］；二組是組心組外組膜組上組的c－kit＋細(xì)胞，心肌損傷后，可溶性細(xì)胞因子釋放進(jìn)入心包液，可刺激心外膜的c－kit＋細(xì)胞分化，通過促血管再生和調(diào)節(jié)心肌組織結(jié)構(gòu)來促進(jìn)心肌再生［28］；三是循環(huán)中的干細(xì)胞，骨髓衍生的干細(xì)胞等成體干細(xì)胞，可在損傷信號誘導(dǎo)下進(jìn)入外周血，募集到心肌損傷部位進(jìn)行分化，在一定程度上修復(fù)心肌組織［33，50］；四是eCSCs，eCSCs可表達(dá)c－kit、Sca1 和IsL－1等干細(xì)胞表面標(biāo)記，具有一定心肌化功能，在損傷微環(huán)境誘導(dǎo)下eCSCs 可增殖分化，直接參與心肌損傷的修復(fù)［7，26，29］。eCSCs為心肌損傷組后的修復(fù)組提組供組了直接的組細(xì)組胞來源，Urbanek等發(fā)現(xiàn)，在急性或慢性MI心臟中，CSCs數(shù)目均顯著增加［46］。Lin－c－kit＋eCSCs已被證實可參與功能性心肌再生［7］。此外，自體骨髓干細(xì)胞由于具有多能分化性、數(shù)量多、來源廣泛等特點，已成為關(guān)注的焦點。G－CSF作為有效的干細(xì)胞動員因子，可動員間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）和內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）進(jìn)入外周血，募集到心肌損傷部位［16］，并通過調(diào)控心肌特異基因的表達(dá)，誘導(dǎo)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的分化。有效激活eCSCs和骨髓干細(xì)胞趨化到損傷部位，修復(fù)心肌組織，可為心肌再生奠定了細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。c－kit為經(jīng)典的干細(xì)胞標(biāo)記，可表達(dá)于eCSCs等多種細(xì)胞表面［7］，CD29 和CD44 為MSCs的表面標(biāo)記抗原［12］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，G－CSF干預(yù)可有效促進(jìn)梗死邊緣區(qū)心肌組織c－kit和CD29的表達(dá)，提示G－CSF促進(jìn)了c－kit＋和CD29＋干細(xì)胞歸巢到MI部位，參與心肌組織修復(fù)。Waring等發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動可促進(jìn)心肌組織中ckit＋eCSCs的激活和分化，進(jìn)而促進(jìn)正常心臟的心肌細(xì)胞再生［49］，但對MI心臟是否有效，需要實驗證實。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動促進(jìn)了MI邊緣區(qū)心肌組織c－kit和CD29蛋白表達(dá)升高，且有氧運(yùn)動和G－CSF 雙重干預(yù)顯著高于單純干預(yù)的效果。推測，有氧運(yùn)動可促進(jìn)干細(xì)胞動員歸巢到MI部位，且有氧運(yùn)動和G－CSF 雙重干預(yù)可有效促進(jìn)心肌中c－kit＋、CD29＋和CD44＋干細(xì)胞的增多。分析認(rèn)為，增多的干細(xì)胞群可能包含兩部分，即心肌固有的干細(xì)胞和循環(huán)中骨髓干細(xì)胞等，其具體來源有待于深入研究。

研究證實，包括MSCs在內(nèi)的多種干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)分化過程中，均可激活GATA－4 和Nkx2.5 等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，進(jìn)而啟動心肌化的發(fā)生［4］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動或G－CSF干預(yù)均使心肌組織GATA 4 基因和蛋白表達(dá)有上升趨勢，而二者的聯(lián)合干預(yù)使GATA 4 表達(dá)顯著性增加，說明聯(lián)合干預(yù)更有效地促進(jìn)了干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化。分析認(rèn)為，有氧運(yùn)動可顯著上調(diào)心肌組織中多種細(xì)胞因子的表達(dá)［14］，而生長因子對于心肌細(xì)胞的增殖和干細(xì)胞的分化具有促進(jìn)組作用［49］；G－CSF組動組員組效果較好，二組者組聯(lián)合干預(yù)可通過促進(jìn)生長因子的表達(dá)，促進(jìn)了干細(xì)胞的分化，參與心肌細(xì)胞的再生。

3.4 有氧運(yùn)動和／或G－CSF 干預(yù)促進(jìn)干細(xì)胞歸巢的機(jī)制探討

心肌干細(xì)胞或自體其他成體干細(xì)胞修復(fù)心肌組織，其過程包括干細(xì)胞的動員、歸巢、遷移和分化，并與損傷微環(huán)境的趨化因子和細(xì)胞因子密切相關(guān)。心梗可誘導(dǎo)心臟損傷部位產(chǎn)生大量趨化因子，如白介素－8（interleukin，IL－8），SDF－1α和MCP－1 等。循環(huán)中的干細(xì)胞可被誘導(dǎo)因素如G－CSF動員進(jìn)入外周血，循環(huán)至損傷部位，通過粘附分子（VLA－4等）的介導(dǎo)粘附于內(nèi)皮細(xì)胞，由趨化因子介導(dǎo)穿過內(nèi)皮細(xì)胞遷徙到組織中，進(jìn)入損傷組織中定居、分化和增殖［40］，其中，SDF－1／CXCR4組信組號組軸組的組發(fā)組現(xiàn)，揭組示組了組干組細(xì)胞趨化歸巢的重要機(jī)制［27］。有實驗表明，大鼠MI區(qū)周圍通過移植轉(zhuǎn)染了SDF－1 基因的成體心肌細(xì)胞，同時給予G－CSF可誘導(dǎo)CD117＋干細(xì)胞歸巢到梗死區(qū)，而未表達(dá)SDF－1的移植細(xì)胞及G－CSF干預(yù)，其細(xì)胞歸巢效果均無統(tǒng)計學(xué)組意組義［5］。Abbott等組研組究組發(fā)組現(xiàn)，SDF－1／CXCR4組信組號組軸的阻斷，可顯著減少骨髓干細(xì)胞移植后進(jìn)入MI區(qū)的數(shù)目［3］，充分組說組明組了SDF－1／CXCR4組信號組軸組在組干細(xì)胞歸組巢組中的作用。本研究實驗顯示，MI大鼠VLA－4 蛋白表達(dá)增加，SDF－1、CXCR4和MCP－1均無顯著性差異，而有氧運(yùn)動或G－CSF干預(yù)均使大鼠心肌組織VLA－4 和CXCR4 蛋白表達(dá)顯著增加，SDF－1 和MCP－1組無組顯組著組性組差組異，且組二組者組聯(lián)合干預(yù)組使CXCR4組表組達(dá)組高組于組單組純組運(yùn)組動組干組預(yù)。SDF－1組和MCP－1在MI發(fā)生的早期表達(dá)增高，后期在運(yùn)動過程中會產(chǎn)生適應(yīng)現(xiàn)象，導(dǎo)致SDF－1 和MCP－1 差異不顯著。目前關(guān)于有氧運(yùn)動與CXCR4表達(dá)的關(guān)系未見報道。M－CSF 或G－CSF動員劑干預(yù)均可動員CXCR4＋細(xì)胞通過SDF－1／CXCR4信號軸歸巢于心梗部位，使心梗死面積縮小，改善MI后左心室的病理性重塑［31］。本研究實驗發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動和G－CSF雙重干預(yù)可使大鼠心肌CXCR4 表達(dá)顯著增加，提示二者有效動員了CXCR4＋細(xì)胞，通過VLA－4 等粘附因子遷移到心肌損傷部位，促進(jìn)了梗死大鼠心肌中的干細(xì)胞數(shù)目。

MI后心功能的提升由多種因素決定，包括保護(hù)現(xiàn)存的心肌細(xì)胞，降低纖維化程度和心肌細(xì)胞丟失水平，促進(jìn)心肌細(xì)胞和血管再生，改善氧化應(yīng)激和神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控等。細(xì)胞周期調(diào)控因子、促血管生成素－1（Angiopoietin－1）、血管內(nèi)皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）、胰組島組素組樣組生組長組因組子－1（Insulin－like Growth Factor，IGF－1）和組肝組細(xì)組胞組生組長組因組子（Hepatocyte Growth Factor，HGF）等均對心梗心臟的心肌細(xì)胞數(shù)目增多具有積極作用［37，43，44，51］，并且發(fā)現(xiàn)Periostin、Neuregulin1／ErbB4以及C／EBPβ在心肌細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮正性或負(fù)性調(diào)節(jié)作用［10，11，25］。運(yùn)動作為一種組整組體組刺組激組效組應(yīng)，可組對組機(jī)組體組產(chǎn)組生組系統(tǒng)性影響。動物實驗表明，運(yùn)動可通過抑制心肌細(xì)胞凋亡［15］、減輕纖維化程度［52］、降低氧化應(yīng)激［53］等組方組面組有組效組提高M(jìn)I后的心功能。但關(guān)于有氧運(yùn)動促進(jìn)MI后心肌細(xì)胞再生至今尚無文獻(xiàn)報道。本研究首次發(fā)現(xiàn)有氧運(yùn)動和GCSF可通過SDF－1／CXCR4軸，有效促進(jìn)MI后成體干細(xì)胞的動員、歸巢和分化，促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖，提升心功能，但上述促生長因子和信號通路在運(yùn)動促進(jìn)心肌再生中的作用仍需深入研究。

4 結(jié)論

有氧運(yùn)動和／或G－CSF干預(yù)均可減輕心梗心臟的替代性纖維化，有效提升大鼠心功能；發(fā)現(xiàn)有氧運(yùn)動和G－CSF可通過SDF－1／CXCR4軸，有效促進(jìn)MI后成體干細(xì)胞的動員、歸巢和分化，促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖，有效提升心功能，且二者聯(lián)合干預(yù)效果更為顯著。

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