李 華，韋立蓓，王育斌

(1.武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北武漢430064;2.武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系)

γδT細(xì)胞具有天然免疫的特點(diǎn)，在整個(gè)T細(xì)胞群體中所占的比例雖較少，但當(dāng)各種感染和疾病發(fā)生時(shí)，能為機(jī)體提供第一道防線。近年來，γδT細(xì)胞在抗感染、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等方面的作用成為研究者關(guān)注的熱點(diǎn)［1］。人γδT細(xì)胞有兩個(gè)主要的亞群，即 Vδ1T和 Vδ2T細(xì)胞。Vδ1T細(xì)胞主要分布在人上皮組織中，Vδ2T細(xì)胞主要分布在人外周血中。研究［2］報(bào)道在一些實(shí)體瘤(如結(jié)腸腫瘤、乳腺腫瘤)中有γδT細(xì)胞的浸潤(rùn)，同時(shí)實(shí)驗(yàn)研究證明，γδT細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞顯示了較為廣譜的殺傷活性。我們以往的研究［3，4］也發(fā)現(xiàn)在宮頸癌組織有γδT細(xì)胞浸潤(rùn)，并經(jīng)體外擴(kuò)增后對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞有較強(qiáng)的殺傷作用。本研究通過MTT法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)γδT細(xì)胞對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖和凋亡的影響，進(jìn)一步探討γδT細(xì)胞體外殺傷宮頸癌細(xì)胞的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

人宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞由武漢大學(xué)中南醫(yī)院腫瘤防治研究中心提供，人宮頸癌新鮮標(biāo)本由湖北省腫瘤醫(yī)院提供?？筎CRγδ單克隆抗體、PE標(biāo)記的抗TCRγδ抗體(IgG1，clone IMMU 510)及PE標(biāo)記的同型對(duì)照(clone 679.1Mc7)購(gòu)于法國(guó)Immunotech公司，Annexin-V-FICT/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自上海美季生物技術(shù)有限公司，RPMI-1640培養(yǎng)基、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，小牛血清、胰蛋白酶及MTT檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。實(shí)驗(yàn)中涉及到人宮頸癌標(biāo)本及臨床資料的收集經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并與患者簽署了知情同意書。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

無菌采集宮頸癌患者手術(shù)切除的腫瘤組織塊，用RPMI 1640完全培養(yǎng)基清洗后去除壞死組織及周邊的正常組織，分離出腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocytes，TIL)并制成細(xì)胞懸液，取1ml的細(xì)胞懸液參照文獻(xiàn)［4］常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)3～4周后采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行表型鑒定，選取TCRγδ抗體陽性細(xì)胞比例90.0%以上(即高純度的γδT細(xì)胞)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將人宮頸癌HeLa細(xì)胞置于RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含100ml/L小牛血清)、37℃、5%CO2和飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞(靶細(xì)胞)，接種于96孔培養(yǎng)板(每孔含1×104個(gè)細(xì)胞)，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后分別加入不同濃度的γδT細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞)，使靶/效比為1∶0、1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶4、1∶16 和1∶32)，置于培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2)中繼續(xù)共培養(yǎng)24h和48h后，用PBS洗去γδT細(xì)胞，收集貼壁的HeLa細(xì)胞用于MTT法檢測(cè)，具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上，讀取490nm處D值，HeLa細(xì)胞增殖率計(jì)算公式:增殖率 (%)= (D效靶反應(yīng)孔- D靶細(xì)胞自然釋放孔-

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

按上述培養(yǎng)條件和方法將HeLa細(xì)胞和γδT細(xì)胞(1∶4)共培養(yǎng)24h，并以不加 γδT細(xì)胞為對(duì)照;PBS輕輕洗去γδT細(xì)胞，用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化15min，用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次，2000rpm，離心5min，收集 HeLa細(xì)胞;用400μl 1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞，調(diào)整密度為1×106個(gè)/ml，在細(xì)胞懸浮液中加入5μl FITC標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白-V(FITC-Annexin-V)，輕輕混勻后于2℃ ～8℃避光條件下孵育15min;加入10μl碘化丙啶(PI)后輕輕混勻于2℃ ～8℃避光條件下孵育5min。于1h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，計(jì)數(shù)資料用率或百分比表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)的比較采用方差分析，方差分析中兩組間均數(shù)的比較采用q檢驗(yàn)，P＜0.05或P＜0.01表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 γδT細(xì)胞抑制HeLa細(xì)胞的增殖

MTT法檢測(cè)結(jié)果(圖1)顯示，與不加γδT細(xì)胞(1∶0)比較，各效靶比HeLa細(xì)胞的增殖率顯著降低并呈現(xiàn)劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，靶細(xì)胞∶效應(yīng)細(xì)胞為1∶30，共培養(yǎng)24h和48h的增殖率為(40.99±8.42)%、(31.67±8.74)%，表明50%以上的細(xì)胞停止增殖。24h和48h相同比例之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，表明沒有明顯時(shí)間依賴性。

圖1 γδT細(xì)胞對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響

2.2 γδT細(xì)胞促進(jìn)HeLa細(xì)胞的凋亡

HeLa細(xì)胞和γδT細(xì)胞(1∶7.5)共培養(yǎng)24h后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)(圖2)，以FITC-Annexin-V和PI染色雙陽性的細(xì)胞比例代表凋亡的HeLa細(xì)胞比例，結(jié)果顯示，γδT+HeLa組凋亡細(xì)胞率為(31.98±2.56)%，HeLa組為(1.73±0.24)%，表明 γδT細(xì)胞能顯著促進(jìn)HeLa細(xì)胞的凋亡(P＜0.05)。

圖2 γδT細(xì)胞對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，我國(guó)宮頸癌的發(fā)病率及死亡率居世界前列。近年來由于宮頸細(xì)胞學(xué)篩查的普遍應(yīng)用，使其發(fā)病率和死亡率已有明顯下降，但在農(nóng)村和偏遠(yuǎn)的山區(qū)仍呈高發(fā)的態(tài)勢(shì)。宮頸癌治療以手術(shù)及放化療為基本手段，但近年來卵巢癌的治療手段有了長(zhǎng)足的進(jìn)展，其中免疫治療作為腫瘤生物治療的重要組成部分已經(jīng)成為宮頸癌的新治療模式。γδT細(xì)胞作為一種新的腫瘤免疫治療細(xì)胞，無主要組織相容性抗原(MHC)限制性以及不依賴抗原的處理和呈遞過程，直接對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別和殺傷［5］，因此在抗腫瘤中發(fā)揮重要作用。本研究從宮頸癌患者手術(shù)切除的腫瘤組織中分離出TIL，經(jīng)體外擴(kuò)增成功獲得了大量高純度的γδT細(xì)胞，為展開γδT細(xì)胞體外抗腫瘤作用機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。有報(bào)道稱，γδT細(xì)胞可以不依賴于胸腺發(fā)育，在某些組織擁有優(yōu)勢(shì)分布，特別是皮膚、食道、肺和生殖道的上皮內(nèi)，能夠殺傷上皮來源的實(shí)體瘤，比如結(jié)腸腫瘤［6］、腎腫瘤［7］等。本研究中選擇的人宮頸癌細(xì)胞系亦為上皮來源的腫瘤細(xì)胞，在與γδT細(xì)胞按不同比例共培養(yǎng)后，MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，HeLa細(xì)胞的增殖率顯著降低并呈現(xiàn)劑量依賴性，表明γδT細(xì)胞能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，這可能是γδT細(xì)胞抗宮頸癌作用機(jī)制之一。

細(xì)胞凋亡是生理或病理狀態(tài)下都可能發(fā)生的現(xiàn)象，對(duì)機(jī)體正常細(xì)胞群的穩(wěn)定、防御和免疫反應(yīng)、疾病或中毒時(shí)引起的細(xì)胞損傷、老化以及腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展起著重要作用。在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine，PS)位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-V是能與PS高親和力特異性結(jié)合的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白［8］。PI作為一種核酸染料，不能透過完整的細(xì)胞膜，但能夠透過凋亡中、晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此本研究中采用FITC-Annexin-V與PI雙染能將凋亡的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來，結(jié)果直觀可靠。另外，本研究根據(jù)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選擇了合適的比例將γδT細(xì)胞與HeLa細(xì)胞共培養(yǎng)后，利用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示γδT細(xì)胞能顯著促進(jìn)HeLa細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，本研究提示γδT細(xì)胞通過抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用，為臨床開展以γδT細(xì)胞為基礎(chǔ)的免疫治療提供了參考依據(jù)。

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