陳 銳,阿依夏木,馬玉花,丁遠(yuǎn)大,封 順

(1.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院,新疆烏魯木齊,830001;2,新疆大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,新疆烏魯木齊,830046)

結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤,發(fā)生率僅次于胃癌和食道癌。近20年來(lái)結(jié)直腸癌發(fā)病率在逐漸增加,且發(fā)病年齡趨向老齡化。在西方發(fā)達(dá)國(guó)家,結(jié)直腸癌是僅次于肺癌的第2位惡性腫瘤,易發(fā)部位為直腸及直腸與乙狀結(jié)腸交界處,發(fā)病多在60～70歲,50歲以下不到20%[1]。目前結(jié)直腸癌主要治療藥物為奧沙利鉑、5-氟尿嘧啶和亞葉酸鈣,并常組合用藥。其中奧沙利鉑是第1個(gè)顯現(xiàn)對(duì)結(jié)直腸癌有效的絡(luò)鉑類烷化劑,同時(shí)還有另1個(gè)在體內(nèi)外均有廣譜抗腫瘤活性的鉑類抗腫瘤藥物,目前針對(duì)奧沙利鉑的檢測(cè)方法主要是HPLC方法[2-8]。5-氟尿嘧啶是以抗代謝而發(fā)揮作用,在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為有效的氟尿嘧啶脫氧核苷酸后,通過(guò)阻斷脫氧核糖尿苷酸受細(xì)胞內(nèi)胸苷酸合成酶轉(zhuǎn)化為胸苷酸,而干擾DNA的合成,其也可干擾RNA的合成,目前常用的檢測(cè)方法也為HPLC[9-17]。亞葉酸鈣,又稱甲酰四氫葉酸鈣,葉酸,一般用來(lái)解毒和治療貧血,近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其在腫瘤化療中有新的作用,也常用于結(jié)直腸癌的治療。

隨著藥物代謝組學(xué)研究的快速發(fā)展,建立針對(duì)腫瘤研究藥物代謝組學(xué)的一檢測(cè)方法顯得特別重要。目前對(duì)上述3種藥物的分析方法主要基于紫外分光光度法、毛細(xì)管電泳高頻電導(dǎo)檢測(cè)法、HPLC和HPLC-MS法等[18-20],但現(xiàn)有報(bào)道均僅能針對(duì)其中某一種藥物進(jìn)行定量定性分析,并不能實(shí)現(xiàn)對(duì)3種藥物同時(shí)快速檢測(cè)。尿液作為唯一能夠在無(wú)創(chuàng)條件下大量獲得的體液,本文通過(guò)檢測(cè)尿液中這3種藥物的含量,為研究藥物在體內(nèi)的分布、排泄及藥物代謝動(dòng)力學(xué)提供了研究基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 儀器與試劑

BS124S型電子天平(精度0.0001 g,德國(guó)Sartorius公司);雷茲MP230型酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠);高速離心機(jī)(美國(guó) BECKMAN公司,CoulterAvanti J-25);C 18 SPE柱(3 mL,500 mg,美國(guó)Agilent公司);高純水系統(tǒng)(韓國(guó)Classic UF);日本島津高效液相色譜系統(tǒng),包括液相色譜儀LC-10Avp,工作站LC Solution。甲醇(色譜純,Sigma公司),磷酸(天津市富宇精細(xì)化工有限公司),丙酮(天津市富宇精細(xì)化工有限公司),奧沙利鉑(Oxaliplatin,上海麗臣生物有限公司),5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,上海麗臣生物有限公司),亞葉酸鈣(Leucovorin calciu,上海麗臣生物有限公司)。所有試劑如無(wú)特別說(shuō)明,均為分析純,使用前不經(jīng)任何處理;所用水為Milli-Q I級(jí)超純水。

1.2 樣品處理

1.2.1 生物樣品采集:結(jié)直腸癌患者尿液(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院)4份,均為男性,年齡(55±2)歲 ,身高(170±5)cm,體質(zhì)量(65±10)kg。

1.2.2 樣品預(yù)處理:活化SPE小柱:取1 mL甲醇,1 mL水,依次滴加到C18 SPE小柱中,依靠重力,使溶液流出;淋洗:待高純水從SPE小柱中接近滴完,再量取尿液25 μ L,待尿液全部通過(guò)柱子,再分3次加入40%甲醇/水總計(jì)1mL,用1.5 mL EP管收集濾液,放入Speed Vac中離心濃縮至干粉狀,再加入100 μ L高純水進(jìn)行復(fù)溶,放入冰箱以備檢測(cè)。

1.2.3 液相色譜條件:色譜柱:Inertsil ODS(150 mm×4.6 mm,5 μ m);流動(dòng)相 :A,pH=3磷酸水溶液,B,甲醇;A:B=20:80(v/v),流速:1.0 mL/min;柱溫 :室溫 ;進(jìn)樣量:20 μ L;檢測(cè)波長(zhǎng):270 nm。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

分別準(zhǔn)確稱取純品5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑、亞葉酸鈣,并準(zhǔn)確配成1.0×10-3、5.0×10-3、1.0 ×10-2、5.0 ×10-2、0.1、0.5、1.0 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液,于冰箱冷藏保存。

2 結(jié) 果

2.1 流動(dòng)相的選擇

HPLC進(jìn)行藥品分離時(shí),流動(dòng)相的選擇是最為重要的因素,通過(guò)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)3種藥物均為水溶性藥物,因此首先考察了H2O/MeOH體系下3種藥物的拆分效果。

亞葉酸鈣首先出峰,但存在著較為嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象,這是由于亞葉酸鈣為堿性藥物,在C18柱上有著較為嚴(yán)重的非特異性吸附。為降低非特異性吸附,常通過(guò)調(diào)整溶液的pH值來(lái)減弱拖尾。通過(guò)考察不同pH值條件下的分離效果,最終確定最優(yōu)色譜條件為 pH=3磷酸水溶液/甲醇=80/20(v/v)。在此色譜條件下,3種組分5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑、亞葉酸鈣的保留時(shí)間分別為5.251、6.833和 9.187 min,實(shí)現(xiàn)了 3種組分的完全分離。而亞葉酸鈣在此pH值條件下,以亞葉酸的形式存在,其出峰順序由首先出峰轉(zhuǎn)變?yōu)樽詈蟪龇?并且峰形良好。

2.2 方法的線性范圍及檢出限

配置系列標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1.0×10-3、5.0×10-3、1.0 ×10-2、5.0×10-2、0.1、0.5、1.0 mg/mL,以峰面積和質(zhì)量濃度(mg/mL)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,相關(guān)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。從表1可以看出,3種藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線均具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)均大于0.999,說(shuō)明此方法可靠,可用于定量分析。

表1 3種結(jié)直腸癌常用藥品標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程、線性范圍、檢出限

2.3 實(shí)際樣品的測(cè)定

2.3.1 回收率與精密度實(shí)驗(yàn):由于尿液成分復(fù)雜,對(duì)其進(jìn)行分離分析,首先需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理,將尿液中的蛋白類大分子化合物去除。傳統(tǒng)除蛋白的方法為丙酮沉淀法,盡管方法相對(duì)簡(jiǎn)單,但耗時(shí)較長(zhǎng),且移除蛋白后,尿液中仍存在著大量的小分子化合物,這些組分的存在也會(huì)對(duì)3種藥物的分離分析存在干擾。為提高分析速度,減少前處理時(shí)間,同時(shí)盡可能地簡(jiǎn)化樣品的復(fù)雜程度,本文選擇固相萃取法,選擇常用的C18 SPE小柱對(duì)尿液進(jìn)行前處理,并對(duì)上樣、淋洗、洗脫條件進(jìn)行了優(yōu)化,實(shí)現(xiàn)了一步簡(jiǎn)化樣品的目的。

為驗(yàn)證方法的可行性,將4個(gè)尿樣按標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)其回收率進(jìn)行了測(cè)定,所得結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明藥物的平均回收率為93.40%～110.70%,峰面積的RSD均不大于3.1%,表明方法的重復(fù)性良好,所建立的方法可用于實(shí)際樣品中藥物的分離分析。

表2 3種結(jié)直腸癌常見(jiàn)藥物的回收率R(%)和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%)

2.3.2 患者尿樣測(cè)定:在優(yōu)化的色譜條件下,對(duì)4個(gè)結(jié)直腸癌患者尿液樣品進(jìn)行了分析,經(jīng)過(guò)SPE柱處理后的尿液樣品相對(duì)簡(jiǎn)單,僅有少量峰出現(xiàn),且并不干擾3種藥物的分離。

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