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        不同強(qiáng)度電針對(duì)肥胖大鼠附睪脂肪細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響*

        2013-11-07 06:03:10唐成林劉仁建陳曉琳劉祖麗
        中國(guó)病理生理雜志 2013年2期
        關(guān)鍵詞:附睪內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脂肪組織

        郜 婕, 唐成林, 劉仁建, 陳曉琳, 謝 輝, 余 敏, 劉祖麗

        隨著研究者對(duì)肥胖機(jī)制研究的推進(jìn),國(guó)際上對(duì) 肥胖成因的研究已處于分子生物學(xué)水平。肥胖常伴隨炎癥性因子的表達(dá)增加、脂肪組織代謝紊亂及瘦素、胰島素抵抗等病理改變。新近研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)能夠與細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路偶聯(lián),是非感染性致病源引發(fā)炎癥反應(yīng)的主要原因[1]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是合成細(xì)胞內(nèi)分泌蛋白和膜蛋白并進(jìn)行蛋白折疊的主要器官,它對(duì)維持細(xì)胞功能和機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要意義。現(xiàn)階段對(duì)肥胖的研究大多停留在肥胖基因調(diào)控、脂肪組織代謝及炎癥因子表達(dá)[2],鮮見(jiàn)對(duì)脂肪組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的研究。而對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)的監(jiān)測(cè)是判斷脂肪細(xì)胞是否恢復(fù)正常生理功能的關(guān)鍵,可能成為肥胖治療效果的重要依據(jù)。之前的研究中我們證實(shí),電針能調(diào)節(jié)C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)、白細(xì)胞介素 6(interleukin 6,IL-6)、腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、脂肪組織巨噬細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)等炎癥因子的表達(dá)[3-4],改善脂肪組織代謝[5]。本研究通過(guò)觀(guān)察UPR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中幾種信號(hào)分子的改變,探討電針對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的治療作用。

        材料和方法

        1 材料

        1.1 動(dòng)物 健康清潔級(jí)6周齡雄性SD大鼠60只,體重190~210 g,由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(醫(yī)學(xué)動(dòng)物合格證SCXK渝20050002)。

        1.2 主要試劑與儀器 Bcl-2和caspase-12 ELISA試劑盒(R&D公司分裝);Ⅰ抗:p-PERK抗體和CHOP/GADD153抗體(北京博奧森);Ⅱ抗:辣根過(guò)氧化物標(biāo)記生物素(北京博奧森);BCA蛋白定量試劑盒250次(上海貝博);酶標(biāo)儀(Biocell,中國(guó));電泳儀(DYY-6C,中國(guó)北京六一儀器廠(chǎng));Chem Gel-DocXR凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad);華佗牌針灸針(0.25 mm×13 mm,中國(guó)蘇州醫(yī)療用品廠(chǎng)有限公司);恒明牌HM6805-1經(jīng)絡(luò)治療儀(四川恒明科技開(kāi)發(fā)有限公司)。

        2 方法

        2.1 單純性肥胖大鼠模型制備及分組 健康清潔級(jí)雄性SD大鼠60只,6周齡,體重190~210 g。25℃左右恒溫環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)數(shù)字表選取10只大鼠飼以普通飼料,為普食組(common diet group,n=10),其余50只飼以高脂飼料,為模型組(model group,n=50)。飼料配方參考文獻(xiàn)[6]提供的肥胖大鼠造模方法并略加改進(jìn):基礎(chǔ)飼料67%、豬油5%、蔗糖5%、奶粉5%、花生5%、雞蛋10%、麻油1%、食鹽2%。每周各組大鼠稱(chēng)重1次,測(cè)體長(zhǎng)1次。10周后,以體重超過(guò)普食組大鼠體重均數(shù)20%以上為肥胖大鼠納入標(biāo)準(zhǔn),在模型組中得到肥胖大鼠33只,從中篩選30只為高脂飲食(high-fat diet,HFD)組、5 mA 電針(5 mA electroacupuncture,5 mA EA)組和 1 mA 電針(1 mA electroacupuncture,1 mA EA)組,每組10只。普食組繼續(xù)普食喂養(yǎng),高脂飲食組與兩電針組繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)。

        2.2 治療方法 每天上午9:00將各組大鼠固定于自制固定器上。兩電針組選取雙側(cè)足三里(ST 36)和三陰交(SP 6)進(jìn)行針刺,毫針勻速進(jìn)針,直刺5 mm,接通電針。每天1次,每次15 min,連續(xù)治療2周。穴位定位參照李忠仁《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[7]大鼠穴位的定位方法。電針參數(shù):疏密波,頻率20 Hz,強(qiáng)刺激電針組選用5 mA,弱刺激電針組選用1 mA。電針參數(shù)的選擇依據(jù)近年來(lái)不同電針參數(shù)實(shí)驗(yàn)的研究文獻(xiàn)。文獻(xiàn)報(bào)道中大多把電針刺激強(qiáng)度分為3等:弱刺激(≤2 mA)、中等刺激(2~4 mA)和強(qiáng)刺激(≥5 mA)[8]。本實(shí)驗(yàn)選用1 mA(弱刺激)與5 mA(強(qiáng)刺激)作為對(duì)照觀(guān)察。普食組與對(duì)照組不進(jìn)行電針治療,但同時(shí)進(jìn)行固定,排除大鼠應(yīng)激等因素導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)偏倚。

        2.3 檢測(cè)指標(biāo)

        2.3.1 大鼠體重檢測(cè)及日常行為活動(dòng)觀(guān)察 每周五下午由固定人員測(cè)各組大鼠的體重,實(shí)驗(yàn)前后觀(guān)察大鼠攝食量、飲水量、大小便、精神及活動(dòng)情況。

        2.3.2 ELISA檢測(cè)大鼠附睪脂肪組織中Bcl-2及caspase-12的含量 應(yīng)用雙抗體夾心法,按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。100 mg大鼠附睪脂肪組織加入pH 7.4 PBS 1 mL,勻漿器將標(biāo)本充分勻漿。以3 000 r/min離心20 min,收集上清。稀釋標(biāo)準(zhǔn)品,設(shè)空白對(duì)照孔,在酶標(biāo)包被板待測(cè)樣品孔中加樣品稀釋液與待測(cè)樣品,37℃溫育30 min,然后每孔加配置洗滌液洗滌5次,加酶標(biāo)試劑,37℃溫育30 min,洗滌5次。加入顯色劑,37℃避光顯色15 min,用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(A),空白孔調(diào)零,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算脂肪組織樣品中大鼠Bcl-2和caspase-12的含量。

        2.3.3 Western blotting檢測(cè)大鼠附睪脂肪組織中p-PERK和CHOP/GADD153表達(dá) 將100 mg大鼠附睪脂肪組織剪碎,加入0.2 mL RIPA和2 μL PMSF,用勻漿器于冰上充分勻漿。在冰上裂解30 min后,移入離心管,4℃、20 000×g離心30 min,然后將上清液轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中,BCA法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品和樣品緩沖液以4∶1的比例混合,沸水浴5 min。蛋白上樣量均為40 μg總蛋白,10%的SDS-PAGE電泳,電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移至NC膜,用麗春紅染色液對(duì)膜進(jìn)行染色,有條帶則繼續(xù)下一步實(shí)驗(yàn)。將膜置于5%的脫脂牛奶封閉液中,于搖床上封閉1 h,PBST漂洗3次;加入Ⅰ抗,4℃孵育過(guò)夜,取出Ⅰ抗,PBST漂洗3次,每次10 min;加入辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的Ⅱ抗,搖床輕搖1 h,TBST室溫脫色搖床上洗3次,每次10 min;將膜置入發(fā)光盤(pán)中,加入發(fā)光試劑(ECL)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng),然后用膠片曝光、顯影、定影,凝膠成像儀進(jìn)行掃描分析,以目的條帶和內(nèi)參照條帶的灰度比值代表p-PERK和CHOP/GADD153在脂肪組織中的表達(dá)水平。

        3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA),多組之間均數(shù)的兩兩比較采用最小顯著差異t檢驗(yàn)(LSD-t)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        結(jié) 果

        1 電針對(duì)SD大鼠體重的影響

        如表1所示,2周后,高脂飲食組與普食組相比,高脂飲食組大鼠體重仍超過(guò)普食組大鼠體重的20%,與之前一樣為肥胖大鼠。而電針組與高脂飲食組相比,電針組大鼠體重明顯低于高脂飲食組,提示電針在減輕肥胖大鼠體重上效果確切。兩電針組間比較,5 mA EA效果優(yōu)于1 mA EA,提示電針刺激強(qiáng)弱對(duì)減輕體重影響不同,5 mA EA優(yōu)于1 mA EA。

        表1 體重比較Table 1.Comparison of body weight of the rats among the 4 groups before and after treatment(g.Mean ± SD.n=10)

        2 電針對(duì)肥胖大鼠附睪脂肪組織Bcl-2和caspase-12蛋白含量的影響

        如表2所示,高脂飲食組大鼠Bcl-2和caspase-12表達(dá)明顯高于普食組(P<0.01),提示大鼠肥胖時(shí),脂肪組織中Bcl-2和caspase-12的表達(dá)明顯增加;在電針治療后5 mA電針組和1 mA電針組與高脂飲食組相比Bcl-2和caspase-12的表達(dá)都有明顯下降(P<0.01),提示電針對(duì)肥胖大鼠 Bcl-2和caspase-12表達(dá)的增加有一定抑制作用。兩電針組Bcl-2的表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05),與普食組相比仍較高(P<0.05)。5 mA電針組caspase-12的表達(dá)顯著低于1 mA電針組(P<0.05),且與普食組相比無(wú)顯著差異(P>0.05),而1 mA電針組caspase-12的表達(dá)仍高于普食組(P<0.05),提示1 mA電針對(duì)caspase-12表達(dá)的影響較5 mA電針弱,治療效果較5 mA電針差。

        表2 各組大鼠脂肪組織Bcl-2和caspase-12蛋白含量比較Table 2.Comparison of the content of Bcl-2 and caspase-12 in rat epididymal adipose tissues among the 4 groups(ng/L.Mean±SD.n=10)

        3 電針對(duì)肥胖大鼠附睪脂肪組織中p-PERK和CHOP/GADD153表達(dá)水平的影響

        高脂飲食組附睪脂肪組織中p-PERK和CHOP/GADD153表達(dá)明顯高于普食組(P<0.01);與高脂飲食組比較,電針治療后,兩電針組附睪脂肪組織中p-PERK和CHOP/GADD153表達(dá)顯著降低(P<0.01);5 mA電針組附睪脂肪組織中p-PERK和CHOP/GADD153表達(dá)又明顯低于1 mA電針組(P<0.05),見(jiàn)圖1。

        討 論

        最近,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作為引發(fā)慢性炎癥的可能機(jī)制已受到廣泛關(guān)注。肥胖時(shí),能量營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩和細(xì)胞壓力改變激發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,通過(guò)UPR信號(hào)通路即能直接引起炎癥[9]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其相關(guān)的信號(hào)通路成為炎癥和代謝疾病相互作用的潛在作用點(diǎn)[10]。

        目前我們發(fā)現(xiàn)UPR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有3條:需肌醇酶1α信號(hào)通路、PERK信號(hào)通路和活化轉(zhuǎn)錄因子6信號(hào)通路[11]。這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與肥胖誘導(dǎo)的炎癥信號(hào)通路有許多交點(diǎn),包括 JNK-AP1和 NF-κBIKK通路的激活,ROS和NO的產(chǎn)生[12]。另外,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎癥的關(guān)聯(lián)也不是單方面的。炎癥因子的激活,也能加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的損害,由此使機(jī)體處于惡性循環(huán)之中[13]。以?xún)?nèi)質(zhì)網(wǎng)為靶標(biāo)的“細(xì)胞器治療”方法為肥胖及代謝疾病治療提供了新思路。

        Figure 1.Comparison of expression of p-PERK and CHOP in rat epididymal adipose tissues among the 4 groups.1,2:common diet(CD)group;3,4:high-fat diet(HFD)group;5,6:5 mA electroacupuncture(5 mA EA)group;7,8:1 mA electroacupuncture(1 mA EA)group.Mean ± SD.n=10.**P < 0.01 vs CD group;△△P<0.01 vs HFD group;##P <0.01 vs 5 mA EA group.圖1 各組大鼠脂肪組織p-PERK和CHOP的表達(dá)

        PERK是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的一個(gè)跨膜蛋白分子,靜息狀態(tài)下與分子伴侶蛋白BiP相結(jié)合,以無(wú)活性的蛋白復(fù)合體存在。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激出現(xiàn)時(shí),分子蛋白BiP與非折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白多肽結(jié)合而使蛋白復(fù)合體解體,形成有活性的p-PERK[14]。p-PERK是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的典型產(chǎn)物,通過(guò)觀(guān)察細(xì)胞中p-PERK的含量可判斷細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的狀態(tài)。CHOP/GADD153、Bcl-2和caspase-12是細(xì)胞在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)強(qiáng)或過(guò)長(zhǎng)時(shí)間下由 UPR引起細(xì)胞凋亡路徑中的信號(hào)分子[15]。CHOP/GADD153、Bcl-2和caspase-12的高表達(dá)提示細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激已不能維持細(xì)胞功能,細(xì)胞開(kāi)始死亡或凋亡[16]。

        本研究顯示,高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠附睪脂肪組織p-PERK的表達(dá)及凋亡信號(hào)分子CHOP/GADD153、Bcl-2和caspase-12的含量較普食組顯著升高,證實(shí)了肥胖與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)聯(lián)性。電針治療后,p-PERK、CHOP/GADD153、Bcl-2 和 caspase-12的含量較高脂飲食組明顯下降,5 mA EA優(yōu)于1 mA EA,表明我們之前設(shè)想的電針對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的治療作用是正確的。其中,我們發(fā)現(xiàn),5 mA EA各項(xiàng)指標(biāo)中除p-PERK較普食組含量高61.29%,其余指標(biāo)均能恢復(fù)正常水平,提示電針抑制了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡,此時(shí)雖還存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,但程度較弱,細(xì)胞可以維持正常的功能。

        由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激存在于多種疾病過(guò)程中,如糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、神經(jīng)退行性疾病、腫瘤等。本研究只是觀(guān)察了肥胖中電針對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響,電針影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的機(jī)制到底是直接的還是間接的,是否對(duì)其它疾病中存在的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也有治療作用尚不清楚,還有待進(jìn)一步研究。

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