郜 婕， 唐成林， 劉仁建， 陳曉琳， 謝 輝， 余 敏， 劉祖麗

隨著研究者對肥胖機制研究的推進，國際上對 肥胖成因的研究已處于分子生物學水平。肥胖常伴隨炎癥性因子的表達增加、脂肪組織代謝紊亂及瘦素、胰島素抵抗等病理改變。新近研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激－未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)能夠與細胞內(nèi)炎癥反應信號轉(zhuǎn)導通路偶聯(lián)，是非感染性致病源引發(fā)炎癥反應的主要原因［1］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是合成細胞內(nèi)分泌蛋白和膜蛋白并進行蛋白折疊的主要器官，它對維持細胞功能和機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要意義?，F(xiàn)階段對肥胖的研究大多停留在肥胖基因調(diào)控、脂肪組織代謝及炎癥因子表達［2］，鮮見對脂肪組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應的研究。而對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激狀態(tài)的監(jiān)測是判斷脂肪細胞是否恢復正常生理功能的關鍵，可能成為肥胖治療效果的重要依據(jù)。之前的研究中我們證實，電針能調(diào)節(jié)C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)、白細胞介素 6(interleukin 6，IL-6)、腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、脂肪組織巨噬細胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)等炎癥因子的表達［3－4］，改善脂肪組織代謝［5］。本研究通過觀察UPR信號轉(zhuǎn)導通路中幾種信號分子的改變，探討電針對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的治療作用。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 健康清潔級6周齡雄性SD大鼠60只，體重190～210 g，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供(醫(yī)學動物合格證SCXK渝20050002)。

1.2 主要試劑與儀器 Bcl-2和caspase-12 ELISA試劑盒(R＆D公司分裝);Ⅰ抗:p-PERK抗體和CHOP/GADD153抗體(北京博奧森);Ⅱ抗:辣根過氧化物標記生物素(北京博奧森);BCA蛋白定量試劑盒250次(上海貝博);酶標儀(Biocell，中國);電泳儀(DYY-6C，中國北京六一儀器廠);Chem Gel-DocXR凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad);華佗牌針灸針(0.25 mm×13 mm，中國蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);恒明牌HM6805-1經(jīng)絡治療儀(四川恒明科技開發(fā)有限公司)。

2 方法

2.1 單純性肥胖大鼠模型制備及分組 健康清潔級雄性SD大鼠60只，6周齡，體重190～210 g。25℃左右恒溫環(huán)境中適應性喂養(yǎng)1周后，隨機數(shù)字表選取10只大鼠飼以普通飼料，為普食組(common diet group，n=10)，其余50只飼以高脂飼料，為模型組(model group，n=50)。飼料配方參考文獻［6］提供的肥胖大鼠造模方法并略加改進:基礎飼料67%、豬油5%、蔗糖5%、奶粉5%、花生5%、雞蛋10%、麻油1%、食鹽2%。每周各組大鼠稱重1次，測體長1次。10周后，以體重超過普食組大鼠體重均數(shù)20%以上為肥胖大鼠納入標準，在模型組中得到肥胖大鼠33只，從中篩選30只為高脂飲食(high-fat diet，HFD)組、5 mA 電針(5 mA electroacupuncture，5 mA EA)組和 1 mA 電針(1 mA electroacupuncture，1 mA EA)組，每組10只。普食組繼續(xù)普食喂養(yǎng)，高脂飲食組與兩電針組繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)。

2.2 治療方法 每天上午9:00將各組大鼠固定于自制固定器上。兩電針組選取雙側(cè)足三里(ST 36)和三陰交(SP 6)進行針刺，毫針勻速進針，直刺5 mm，接通電針。每天1次，每次15 min，連續(xù)治療2周。穴位定位參照李忠仁《實驗針灸學》［7］大鼠穴位的定位方法。電針參數(shù):疏密波，頻率20 Hz，強刺激電針組選用5 mA，弱刺激電針組選用1 mA。電針參數(shù)的選擇依據(jù)近年來不同電針參數(shù)實驗的研究文獻。文獻報道中大多把電針刺激強度分為3等:弱刺激(≤2 mA)、中等刺激(2～4 mA)和強刺激(≥5 mA)［8］。本實驗選用1 mA(弱刺激)與5 mA(強刺激)作為對照觀察。普食組與對照組不進行電針治療，但同時進行固定，排除大鼠應激等因素導致的實驗偏倚。

2.3 檢測指標

2.3.1 大鼠體重檢測及日常行為活動觀察 每周五下午由固定人員測各組大鼠的體重，實驗前后觀察大鼠攝食量、飲水量、大小便、精神及活動情況。

2.3.2 ELISA檢測大鼠附睪脂肪組織中Bcl-2及caspase-12的含量 應用雙抗體夾心法，按照ELISA試劑盒說明書進行操作。100 mg大鼠附睪脂肪組織加入pH 7.4 PBS 1 mL，勻漿器將標本充分勻漿。以3 000 r/min離心20 min，收集上清。稀釋標準品，設空白對照孔，在酶標包被板待測樣品孔中加樣品稀釋液與待測樣品，37℃溫育30 min，然后每孔加配置洗滌液洗滌5次，加酶標試劑，37℃溫育30 min，洗滌5次。加入顯色劑，37℃避光顯色15 min，用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(A)，空白孔調(diào)零，通過標準曲線計算脂肪組織樣品中大鼠Bcl-2和caspase-12的含量。

2.3.3 Western blotting檢測大鼠附睪脂肪組織中p-PERK和CHOP/GADD153表達 將100 mg大鼠附睪脂肪組織剪碎，加入0.2 mL RIPA和2 μL PMSF，用勻漿器于冰上充分勻漿。在冰上裂解30 min后，移入離心管，4℃、20 000×g離心30 min，然后將上清液轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品和樣品緩沖液以4∶1的比例混合，沸水浴5 min。蛋白上樣量均為40 μg總蛋白，10%的SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移至NC膜，用麗春紅染色液對膜進行染色，有條帶則繼續(xù)下一步實驗。將膜置于5%的脫脂牛奶封閉液中，于搖床上封閉1 h，PBST漂洗3次;加入Ⅰ抗，4℃孵育過夜，取出Ⅰ抗，PBST漂洗3次，每次10 min;加入辣根過氧化物標記的Ⅱ抗，搖床輕搖1 h，TBST室溫脫色搖床上洗3次，每次10 min;將膜置入發(fā)光盤中，加入發(fā)光試劑(ECL)進行化學發(fā)光反應，然后用膠片曝光、顯影、定影，凝膠成像儀進行掃描分析，以目的條帶和內(nèi)參照條帶的灰度比值代表p-PERK和CHOP/GADD153在脂肪組織中的表達水平。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，多組之間均數(shù)的兩兩比較采用最小顯著差異t檢驗(LSD-t)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 電針對SD大鼠體重的影響

如表1所示，2周后，高脂飲食組與普食組相比，高脂飲食組大鼠體重仍超過普食組大鼠體重的20%，與之前一樣為肥胖大鼠。而電針組與高脂飲食組相比，電針組大鼠體重明顯低于高脂飲食組，提示電針在減輕肥胖大鼠體重上效果確切。兩電針組間比較，5 mA EA效果優(yōu)于1 mA EA，提示電針刺激強弱對減輕體重影響不同，5 mA EA優(yōu)于1 mA EA。

表1 體重比較Table 1.Comparison of body weight of the rats among the 4 groups before and after treatment(g.Mean ± SD.n=10)

2 電針對肥胖大鼠附睪脂肪組織Bcl-2和caspase-12蛋白含量的影響

如表2所示，高脂飲食組大鼠Bcl-2和caspase-12表達明顯高于普食組(P＜0.01)，提示大鼠肥胖時，脂肪組織中Bcl-2和caspase-12的表達明顯增加;在電針治療后5 mA電針組和1 mA電針組與高脂飲食組相比Bcl-2和caspase-12的表達都有明顯下降(P＜0.01)，提示電針對肥胖大鼠 Bcl-2和caspase-12表達的增加有一定抑制作用。兩電針組Bcl-2的表達無顯著差異(P＞0.05)，與普食組相比仍較高(P＜0.05)。5 mA電針組caspase-12的表達顯著低于1 mA電針組(P＜0.05)，且與普食組相比無顯著差異(P＞0.05)，而1 mA電針組caspase-12的表達仍高于普食組(P＜0.05)，提示1 mA電針對caspase-12表達的影響較5 mA電針弱，治療效果較5 mA電針差。

表2 各組大鼠脂肪組織Bcl-2和caspase-12蛋白含量比較Table 2.Comparison of the content of Bcl-2 and caspase-12 in rat epididymal adipose tissues among the 4 groups(ng/L.Mean±SD.n=10)

3 電針對肥胖大鼠附睪脂肪組織中p-PERK和CHOP/GADD153表達水平的影響

高脂飲食組附睪脂肪組織中p-PERK和CHOP/GADD153表達明顯高于普食組(P＜0.01);與高脂飲食組比較，電針治療后，兩電針組附睪脂肪組織中p-PERK和CHOP/GADD153表達顯著降低(P＜0.01);5 mA電針組附睪脂肪組織中p-PERK和CHOP/GADD153表達又明顯低于1 mA電針組(P＜0.05)，見圖1。

討 論

最近，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激作為引發(fā)慢性炎癥的可能機制已受到廣泛關注。肥胖時，能量營養(yǎng)過剩和細胞壓力改變激發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，通過UPR信號通路即能直接引起炎癥［9］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及其相關的信號通路成為炎癥和代謝疾病相互作用的潛在作用點［10］。

目前我們發(fā)現(xiàn)UPR信號轉(zhuǎn)導通路有3條:需肌醇酶1α信號通路、PERK信號通路和活化轉(zhuǎn)錄因子6信號通路［11］。這些信號轉(zhuǎn)導通路與肥胖誘導的炎癥信號通路有許多交點，包括 JNK-AP1和 NF-κBIKK通路的激活，ROS和NO的產(chǎn)生［12］。另外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和炎癥的關聯(lián)也不是單方面的。炎癥因子的激活，也能加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的損害，由此使機體處于惡性循環(huán)之中［13］。以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為靶標的“細胞器治療”方法為肥胖及代謝疾病治療提供了新思路。

Figure 1.Comparison of expression of p-PERK and CHOP in rat epididymal adipose tissues among the 4 groups.1，2:common diet(CD)group;3，4:high-fat diet(HFD)group;5，6:5 mA electroacupuncture(5 mA EA)group;7，8:1 mA electroacupuncture(1 mA EA)group.Mean ± SD.n=10.＊＊P ＜ 0.01 vs CD group;△△P＜0.01 vs HFD group;##P ＜0.01 vs 5 mA EA group.圖1 各組大鼠脂肪組織p-PERK和CHOP的表達

PERK是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的一個跨膜蛋白分子，靜息狀態(tài)下與分子伴侶蛋白BiP相結(jié)合，以無活性的蛋白復合體存在。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激出現(xiàn)時，分子蛋白BiP與非折疊或錯誤折疊的蛋白多肽結(jié)合而使蛋白復合體解體，形成有活性的p-PERK［14］。p-PERK是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的典型產(chǎn)物，通過觀察細胞中p-PERK的含量可判斷細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的狀態(tài)。CHOP/GADD153、Bcl-2和caspase-12是細胞在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激過強或過長時間下由 UPR引起細胞凋亡路徑中的信號分子［15］。CHOP/GADD153、Bcl-2和caspase-12的高表達提示細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激已不能維持細胞功能，細胞開始死亡或凋亡［16］。

本研究顯示，高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠附睪脂肪組織p-PERK的表達及凋亡信號分子CHOP/GADD153、Bcl-2和caspase-12的含量較普食組顯著升高，證實了肥胖與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的關聯(lián)性。電針治療后，p-PERK、CHOP/GADD153、Bcl-2 和 caspase-12的含量較高脂飲食組明顯下降，5 mA EA優(yōu)于1 mA EA，表明我們之前設想的電針對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的治療作用是正確的。其中，我們發(fā)現(xiàn)，5 mA EA各項指標中除p-PERK較普食組含量高61.29%，其余指標均能恢復正常水平，提示電針抑制了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激引起的細胞凋亡，此時雖還存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，但程度較弱，細胞可以維持正常的功能。

由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激存在于多種疾病過程中，如糖尿病、動脈粥樣硬化、神經(jīng)退行性疾病、腫瘤等。本研究只是觀察了肥胖中電針對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的影響，電針影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的機制到底是直接的還是間接的，是否對其它疾病中存在的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激也有治療作用尚不清楚，還有待進一步研究。

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