呂 雷， 林 康， 高偉陽， 何智靈， 高自勉， 李浙峰， 李俊杰

增生性瘢痕(hypertrophic scar，HS)是病理性瘢痕的一種，是以成纖維細(xì)胞增殖失控、膠原過度沉積為主要特征的結(jié)締組織疾病，其發(fā)病機(jī)制至今仍不清楚。自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞中的生命現(xiàn)象，在多種退變性疾病的病理過程中亦起著極為重要的作用。目前研究表明自噬與心肌［1］、腎臟［2］等器官纖維化密切相關(guān)，其在增生性瘢痕的形成過程中是否起作用，目前尚不清楚。本研究應(yīng)用饑餓誘導(dǎo)方法來觀察增生性瘢痕中成纖維細(xì)胞自噬現(xiàn)象及自噬水平，以探討自噬在增生性瘢痕中的作用和意義。

材料和方法

1 材料

DMEM培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清(四季青)，EBSS(Gibco)，單丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverine，MDC)熒光染料(Gibco)，RIPA細(xì)胞裂解液、SDSPAGE凝膠配制試劑盒(上海碧云天公司)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒及ECL發(fā)光液(Thermo)，微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)、自噬相關(guān)蛋白Beclin-1及GAPDH兔抗人多克隆抗體(CST);羊抗兔辣根過氧化物酶IgG(北京康為世紀(jì)公司)，Trizol(Invitrogen)，RT-PCR試劑盒(Thermo)，SYBR Green I Master(Roche)。

2 成纖維細(xì)胞培養(yǎng)

增生性瘢痕標(biāo)本來源于手術(shù)切除的增生性瘢痕組織，色澤紅，質(zhì)硬，高出皮膚表面，瘢痕形成不超過1年，取材部位無感染和潰瘍，且未經(jīng)任何治療，不伴有腫瘤或其它結(jié)締組織疾病。采用組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行原代培養(yǎng)，在無菌條件下切除瘢痕表皮及皮下組織，在少量胎牛血清中將標(biāo)本切成1 mm×1 mm×1 mm左右的組織塊置于25 cm2培養(yǎng)瓶中，2 h后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。當(dāng)原代細(xì)胞生長(zhǎng)成單層，用0.25% 胰蛋白酶消化，按1∶2的比例傳代培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)用第3～6代細(xì)胞。

3 實(shí)驗(yàn)分組

選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好3～6代的成纖維細(xì)胞，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。細(xì)胞分為4組，用EBSS平衡鹽溶液饑餓細(xì)胞 1 h、2 h、3 h，對(duì)照組用 10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。處理組和對(duì)照組均重復(fù)3次以上。

4 Western blotting檢測(cè)LC3和Beclin-1蛋白表達(dá)

在6孔板中將各組細(xì)胞用預(yù)冷PBS洗2遍后，加入適量的細(xì)胞裂解液(radio immunoprepciption assay buffer，RIPA)和蛋白酶抑制劑(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)，超聲裂解提取蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度，12%SDS-PAGE電泳，將LC3目的蛋白轉(zhuǎn)至0.22 μm PVDF膜上，Beclin-1和內(nèi)參照轉(zhuǎn)至0.45 μm 的膜上，5% 脫脂牛奶常溫下封閉，孵LC3抗體(1∶1 000)、Beclin-1 抗體(1∶1 000)及GAPDH抗體(1∶1 000)4℃過夜，孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶3 000)，ECL發(fā)光液顯色。

5 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)LC3和Beclin-1 mRNA表達(dá)

以Trizol法提取上述方法刺激后獲取的細(xì)胞總RNA，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及純度(A260/A280＞1.8)。根據(jù)濃度取1 μg總 RNA 按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。LC3上游引物5’-CAACATGAGCGAGTTGGTCAAGA-3’，下游引物 5’-ACTCACCATGCTGTGCTGGTTC-3’;Beclin-1 上游引物 5’-ATGCAGGTGAGCTTCGTGTG-3’，下 游 引 物 5’-CTGGGCTGTGCTAAGTAATGGA-3’;GAPDH 上游引物 5’-AACGGATTTGGTCGTATTGGG-3’，下游引物 5’-TCGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3’。以上引物由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成。在無菌去酶的Eppendorf管中按照說明書將配置好的real-time PCR反應(yīng)液(反應(yīng)總體積為20 μL)離心數(shù)秒，混勻后迅速置入Roche LightCycler?480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中，兩步法qRT-PCR擴(kuò)增程序:預(yù)變性95℃ 5 min，95℃10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，45 個(gè)循環(huán)，獲得各樣本待測(cè)基因的 Ct值。采用2-ΔΔCt法進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理，其結(jié)果代表各目的基因表達(dá)的相對(duì)定量，以對(duì)照組作為矯正樣本。

6 MDC熒光染色

按Biederbick等［3］實(shí)驗(yàn)方法，將細(xì)胞處理完后，去培養(yǎng)基，PBS洗2次，用0.05 mmol/L MDC于37℃溫育50 min后，吸去染料，PBS洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗2次，晾干后立刻用熒光顯微鏡在400倍視野下觀察，激發(fā)濾片為365 nm，阻斷濾片為430 nm。

7 透射電鏡掃描

各組取1瓶細(xì)胞，處理后并離心成團(tuán)，在EP管中加入2%戊二醛4℃固定過夜，PBS漂洗，1%鋨酸固定，1%醋酸鈾塊染，梯度丙酮脫水，包埋液包埋、固化，半薄切片及甲苯胺藍(lán)染色進(jìn)行定位，LKB-V超薄切片機(jī)超薄切片，透射電鏡下觀察成纖維細(xì)胞。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)采用組間單因素方差分析及LSD法進(jìn)行兩兩比較，統(tǒng)計(jì)軟件采用 SPSS 13.0軟件處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Western blotting檢測(cè) LC3和Beclin-1的蛋白表達(dá)

饑餓處理 1 h后 LC3-II/LC3-Ⅰ和 Beclin-1/GAPDH增高，2 h達(dá)到高峰，3 h逐漸下降，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);Beclin-1在饑餓處理1 h后表達(dá)增高，2 h達(dá)到高峰后逐漸下降，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖1。

2 熒光定量RT-PCR檢測(cè)LC3和Beclin-1的mRNA表達(dá)

LC3 mRNA表達(dá)在饑餓處理1 h后即有增高，2 h達(dá)到高峰，3 h下降，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);Beclin-1 mRNA在饑餓處理1 h后表達(dá)增高，2 h達(dá)到高峰，3 h逐漸下降，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖2。

Figure 1.Western blotting analysis of protein expression of LC3 and beclin 1.Mean ± SD.n=3.*P ＜0.05 vs control.圖1 各組細(xì)胞LC3和Beclin-1蛋白的表達(dá)

Figure 2.LC3 and Beclin-1 mRNA expression assessed by realtime fluorescence quantitative RT-PCR.Mean±SD.n=3.*P ＜ 0.05 vs control.圖2 各組細(xì)胞LC3和Beclin-1 mRNA的表達(dá)

3 MDC熒光染色觀察

MDC熒光染料作為自噬泡的示蹤劑，在熒光顯微鏡下呈藍(lán)綠色點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，多分布于核周。對(duì)照組細(xì)胞中可見少量的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu);饑餓處理2 h后，MDC陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，藍(lán)綠色點(diǎn)狀密度也明顯升高，見圖3。

Figure 3.MDC staining of the autophagic vacuoles in hypertrophic scar fibroblasts(×400).A:control;B:2 h after starvation.圖3 增生性瘢痕成纖維細(xì)胞MDC熒光染色

4 透射電鏡觀察

透射電鏡下可見，對(duì)照組細(xì)胞核較大，核仁明顯，胞漿內(nèi)清晰可見線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。饑餓處理2 h后細(xì)胞胞漿內(nèi)可見大量囊泡狀結(jié)構(gòu)，在高倍鏡下可見雙層膜結(jié)構(gòu)，包含著未消化的胞漿成分或細(xì)胞器，見圖4。

Figure 4.Electron micrographs of hypertrophic scar fibroblasts.A:control;B:2 h after starvation.圖4 電鏡觀察增生性瘢痕成纖維細(xì)胞

討 論

自噬廣泛存在于真核細(xì)胞中，是一個(gè)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)通過溶酶體被降解的過程，生命體借此保持正常的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化及代謝平衡，以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定［4］。當(dāng)自噬功能被抑制或干擾時(shí)，細(xì)胞的降解功能會(huì)出現(xiàn)障礙，并導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，如腫瘤、神經(jīng)退行性疾病等［5-7］。近年來研究發(fā)現(xiàn)自噬在心肌、腎臟等器官纖維化發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。Tannous等［1］發(fā)現(xiàn)自噬不足促進(jìn)心肌間質(zhì)纖維化。Kim等［2］研究表明自噬與腎纖維化有關(guān)，誘導(dǎo)自噬能明顯降低膠原I的蛋白表達(dá)。在皮膚中也發(fā)現(xiàn)增生性瘢痕組織自噬表達(dá)水平較正常皮膚組織明顯降低，提示增生性瘢痕的發(fā)生可能與自噬不足有關(guān)［8］。然而，能否在體外細(xì)胞水平誘導(dǎo)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞發(fā)生自噬，成為進(jìn)一步研究自噬與增生性瘢痕形成關(guān)系的關(guān)鍵。

饑餓法是目前誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的一種經(jīng)典方法，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的自噬研究中應(yīng)用廣泛［9-10］。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用EBSS代替培養(yǎng)液，為增生性瘢痕成纖維營(yíng)造饑餓環(huán)境，然后檢測(cè)自噬相關(guān)指標(biāo)，研究營(yíng)養(yǎng)缺乏對(duì)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞自噬的影響。

LC3是酵母菌自噬相關(guān)蛋白Atg8在哺乳動(dòng)物中的同源體，調(diào)控微管蛋白的組裝和去組裝，參與自噬體的形成。LC3具有2種形式:LC3-Ⅰ和 LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，常作為自噬的特異性標(biāo)志物。Beclin-1是酵母Atg6/Vps30在哺乳動(dòng)物中的同源體，表達(dá)于反面高爾基網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與Ⅲ型PI3K和Atg14L結(jié)合形成復(fù)合體，調(diào)控自噬前體產(chǎn)生和自噬體形成［11］。我們應(yīng)用Western blotting及熒光定量RT-PCR檢測(cè)LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白和mRNA的表達(dá)，隨饑餓時(shí)間延長(zhǎng)而升高，2 h達(dá)到高峰，較對(duì)照組明顯升高，表明饑餓可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞自噬的發(fā)生。通過MDC熒光染色觀察，饑餓處理2 h，MDC陽性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯增加;電鏡是證明自噬現(xiàn)象的金標(biāo)準(zhǔn)，我們?cè)陔婄R下觀察到饑餓處理2 h細(xì)胞內(nèi)存在自噬體，進(jìn)一步證實(shí)饑餓可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞自噬的發(fā)生。

增生性瘢痕發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，自噬在其中的作用及機(jī)制尚不清楚，可能與細(xì)胞凋亡［12］、膠原降解［13］等有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)在體外成功應(yīng)用饑餓誘導(dǎo)出增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的自噬，為進(jìn)一步在細(xì)胞及分子水平研究自噬與增生性瘢痕形成的關(guān)系提供一定的基礎(chǔ)，從而為將來防治增生性瘢痕提供理論依據(jù)和新的治療靶點(diǎn)。

［1］ Tannous P，Zhu H，Johnstone JL，et al.Autophagy is an adaptive response in desmin-related cardiomyopathy［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105(28):9745-9750.

［2］ Kim SI，Na HJ，Ding Y，et al.Autophagy promotes intracellular degradation of type I collagen induced by transforming growth factor(TGF)-β1［J］.J Biol Chem，2012，287(15):11677-11688.

［3］ Biederbick A，Kern HF，Els?sser HP.Monodansylcadverine(MDC)is a specific in vivo marker for autophagic vacuoles［J］.Eur J Cell Biol，1995，66(1):3-14.

［4］ Levine B，Kroemer G.Autophagy in the pathogenesis of disease［J］.Cell，2008，132(1):27-42.

［5］ Jin S，White E.Tumor suppression by autophagy through the management of metabolic stress［J］.Autophagy，2008，4(5):563-566.

［6］ Winslow AR，Rubinsztein DC.Autophagy in neurodegeneration and development［J］.Biochim Biophys Acta，2008，1782(12):723-729.

［7］ 胡鵬飛，賴東武，何 紅.自噬在晚期糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用［J］.中國病理生理雜志，2012，28(6):1006-1011.

［8］ Shi JH，Hu DH，Zhang ZF，et al.Reduced expression of microtubule-associated protein 1 light chain 3 in hypertrophic scars［J］.Arch Dermatol Res，2012，304(3):209-215.

［9］ Kroemer G，Marino G，Levine B.Autophagy and the integrated stress response［J］.Mol Cell，2010，40(2):280-293.

［10］ 江立波，張小磊，徐華梓，等.細(xì)胞自噬對(duì)饑餓環(huán)境下椎間盤髓核細(xì)胞的保護(hù)作用［J］.中國病理生理雜志，2012，28(7):1302-1307.

［11］ Kihara A，Kabeya Y，Ohsumi Y，et al.Beclin-phosphatidylinositol 3-kinase complex functions at the trans-Golgi network［J］.EMBO Rep，2001，2(4):330-335.

［12］ Gordy C，He YW.The crosstalk between autophagy and apoptosis:where does this lead?［J］.Protein Cell，2012，3(1):17-27.

［13］ Ishida Y，Yamamoto A，Kitamura A，et al.Autophagic elimination of misfolded procollagen aggregates in the endoplasmic reticulum as a means of cell protection［J］.Mol Biol Cell，2009，20(11):2744-2754.