李 飛， 袁 勇， 董吁鋼， 董劍廷， 馮 力， 鄧志華

(1中山市人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東 中山528400;2中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東 廣州510080)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種炎癥性疾?。?］。其中促炎/抗炎細(xì)胞因子的平衡在AS 的形成以及粥樣斑塊的穩(wěn)定中起著重要作用。細(xì)胞因子在動脈粥樣硬化中的表達量高于在正常動脈中的表達，并且促炎細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)含量高于抗炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素10(interleukin-10，IL-10)［2］。這些研究提示，促炎細(xì)胞因子信號的負(fù)向調(diào)控機制可能在抑制斑塊的進展中起著重要作用。細(xì)胞因子信號抑制物(suppressors of cytokine signaling，SOCS)是一系列能夠抑制細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白。近來發(fā)現(xiàn)，SOCS 蛋白家族與AS有著密切關(guān)系。人的動脈粥樣硬化斑塊中巨噬細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞中有SOCS1 及SOCS3 的高表達，且在斑塊炎癥活躍的肩部比纖維化區(qū)表達量要多。反義寡核苷酸技術(shù)靶向下調(diào)ApoE 基因敲除小鼠的SOCS3 基因表達，可通過增加斑塊體積、白細(xì)胞募集及趨化因子表達，促進斑塊的形成［3］。因此，以SOCS 蛋白為靶點，上調(diào)SOCS1 和SOCS3 的表達，減少促炎細(xì)胞因子的生成，可能成為防治AS 的新策略。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)屬于核受體超家族轉(zhuǎn)錄因子。研究表明，PPARγ 的激活能夠抑制動脈粥樣硬化的形成［4］。然而PPARγ 活化對泡沫細(xì)胞SOCS 表達有何影響，尚缺乏充分研究，本研究旨在觀察PPARγ 激動劑羅格列酮對RAW 264.7 細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞促炎/抗炎反應(yīng)以及SOCS1 和SOCS3表達的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

小鼠單核-巨噬細(xì)胞株RAW 264.7 購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所生化所。羅格列酮購自Cayman。DMEM 培養(yǎng)基購自Gibco。新生小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)購自廣州威佳科技有限公司。TNF-α、IL-6 及IL-10 ELISA 試劑盒購自晶美生物工程有限公司(最低檢測標(biāo)準(zhǔn)4 ng/L)。小鼠SOCS1 及SOCS3 單克隆抗體購自MBL。

2 細(xì)胞培養(yǎng)

RAW264. 7 細(xì)胞培養(yǎng)于含10% 小牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃、95%空氣，5%CO2。每隔2 ～3 d 更換1 次培養(yǎng)液。取對數(shù)生長期細(xì)胞進行實驗，實驗前用倒置顯微鏡觀察，形態(tài)良好，折光性強。細(xì)胞密度調(diào)至2 ×108/L，24 h 后換成含0.1%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，次日更換1次培養(yǎng)液，加入ox-LDL(100 mg/L)培養(yǎng)24 h 后加入羅格列酮(20 μmol/L)。

3 RT-PCR 檢測SOCS1 及SOCS3 mRNA 的表達

實驗分組及分別在加入羅格列酮6 h、12 h、24 h后加入TRIzol Reagent 提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)紫外分光光度計檢測純度和濃度。符合要求的總RNA 用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA 第一鏈，以合成的cDNA 為模板，小鼠GAPDH 為內(nèi)參照，小鼠SOCS1 及SOCS3上、下游引物行PCR 檢測。引物由TaKaRa 公司合成，序列:SOCS1 正義鏈5’-AGTAGGATGGTAGCACGCAAC-3’，反義鏈5’-AAGGAACTCAGGTAGTCACGG-3’;SOCS3 正義鏈5’-ACTTCACGGCTGCCAACATC-3’，反義鏈5’-GGATGCGTAGGTTCTTGGTC-3’;GAPDH 正 義 鏈5’-TAGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3’，反義鏈5’-CCCCCAATGTATCCGTTGTG-3’。反應(yīng)體系為50 μL，反應(yīng)條件:95 ℃5 min預(yù)變性，94 ℃30 s，退火(SOCS1:60 ℃;SOCS3:59℃;GAPDH:55 ℃)30 s，72 ℃1 min，40 個循環(huán)，72℃7 min。取PCR 擴增產(chǎn)物5 μL 行瓊脂糖凝膠電泳分析，以GAPDH 作內(nèi)參照，計算相對單位。

4 Western blotting 檢測各組SOCS1 及SOCS3 蛋白質(zhì)的水平

實驗分組及分別在加入羅格列酮6 h、12 h、24 h后提取細(xì)胞總蛋白:棄去藥物，用預(yù)泠的PBS 潤洗細(xì)胞后，倒盡吸干PBS，加入RIPA 裂解液，冰上裂解30 min，刮下細(xì)胞，離心，取上清液于-80 ℃保存。提取細(xì)胞總蛋白后經(jīng)Mini BCA 法定量。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和免疫印跡雜交:各取12 μL 提取液，100 ℃變性5 min，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜后封閉，加入Ⅰ抗(SOCS1 及SOCS3 抗體濃度1.5 mg/L)4 ℃過夜，洗膜，加入Ⅱ抗(0.5 g/L)于室溫下作用2 h，洗膜后進行化學(xué)發(fā)光，顯影。根據(jù)各條帶密度的變化，判斷SOCS1 及SOCS3 蛋白質(zhì)的表達情況。

5 培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6 及IL-10 濃度測定

實驗分組及加入羅格列酮24 h 后，ELISA 法檢測各組培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6 及IL-10 的含量。操作步驟按試劑盒說明書進行測得各組的A 值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度和相應(yīng)的A 值為參數(shù)，用SPSS 10.0 統(tǒng)計軟件進行直線回歸處理，得出相應(yīng)的方程;把各標(biāo)本的A值代入方程算出各標(biāo)本中上述細(xì)胞因子的濃度。

6 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 羅格列酮對小鼠RAW 264.7 細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6 及IL-10 的影響

如表1 所示，ox-LDL(100 mg/L)組培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6 及IL-10 的濃度均明顯高于control 組(P ＜0.05)。而加入羅格列酮(20 μmol/L)24 h 后細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6 及IL-10 的濃度均明顯低于ox-LDL 組(P ＜0.05)。

表1 各組培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6 及IL-10 的濃度Table 1. The concentrations of TNF-α，IL-6 and IL-10 in supernatants in various groups (ng/L. ±s.n=6)

表1 各組培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6 及IL-10 的濃度Table 1. The concentrations of TNF-α，IL-6 and IL-10 in supernatants in various groups (ng/L. ±s.n=6)

ROZ:rosiglitazone* P ＜0.05 vs control;#P ＜0.05 vs ox-LDL.

Group TNF-α IL-6 IL-10 Control 21.17±10.31 16.52±7.00 18.75±8.22 ox-LDL 152.22±49.20* 55.53±10.65* 48.63±10.37*ox-LDL+ROZ 38.32±17.98# 26.75±7.97# 30.16±8.71#

2 各組培養(yǎng)上清液TNF-α/IL-10 及IL-6/IL-10 比值變化

如表2 所示，ox-LDL 組TNF-α/IL-10 及IL-6/IL-10 的比值明顯高于control 組。而加入羅格列酮24 h 后，TNF-α/IL-10 及IL-6/IL-10 的比值明顯低于ox-LDL 組(P ＜0.05)。

表2 各組培養(yǎng)液中TNF-α/IL-10 和IL-6/IL-10 比值Table 2. TNF-α /IL-10 and IL-6/IL-10 ratios in supernatants in various groups (±s.n=6)

表2 各組培養(yǎng)液中TNF-α/IL-10 和IL-6/IL-10 比值Table 2. TNF-α /IL-10 and IL-6/IL-10 ratios in supernatants in various groups (±s.n=6)

ROZ:rosiglitazone. * P ＜0. 05 vs control;#P ＜0. 05 vs ox-LDL.

Group TNF-α/IL-10 IL-6/IL-10 Control 1.10 ±0.21 0.88 ±0.08 ox-LDL 3.07 ±0.40* 1.15 ±0.07*ox-LDL+ROZ 1.23 ±0.25# 0.89 ±0.06#

3 羅格列酮對RAW 264. 7 細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞SOCS1 和SOCS3 mRNA 表達的影響

如圖1、2 及表3 所示，control 組與ox-LDL 組只有少量SOCS1 和SOCS3 mRNA 的表達，且二者之間SOCS1 和SOCS3 mRNA 的表達無明顯差別。而LPS(1 mg/L)作用于泡沫細(xì)胞6 h 及羅格列酮作用于泡沫細(xì)胞6 h、12 h 后SOCS1 和SOCS3 mRNA 表達均明顯高于control 組與ox-LDL 組(P ＜0.05)，24 h 后SOCS1 和SOCS3 mRNA 的表達與control 組及ox-LDL 組無明顯差異(P ＞0.05)。

Figure 1. SOCS1 mRNA expression in foam cells in different groups detected by RT-PCR. Foam cells were treated with 100 mg/L ox-LDL or 1 mg/L LPS for 6 h，or 20 μmol/L rosiglitazone (ROZ)for 6 h，12 h or 24 h.圖1 各組泡沫細(xì)胞SOCS1 mRNA 的表達

Figure 2. SOCS3 mRNA expressions in foam cells in different groups detected by RT-PCR. Foam cells were treated with 100 mg/L ox-LDL or 1 mg/L LPS for 6 h or 20 μmol/L rosiglitaqzone (ROZ)for 6 h，12 h or 24 h.圖2 各組泡沫細(xì)胞SOCS3 mRNA 的表達

表3 各組泡沫細(xì)胞SOCS1 和SOCS3 mRNA 的表達Table 3. SOCS1 and SOCS3 mRNA expression in foam cells in different groups (±s.n=3)

表3 各組泡沫細(xì)胞SOCS1 和SOCS3 mRNA 的表達Table 3. SOCS1 and SOCS3 mRNA expression in foam cells in different groups (±s.n=3)

The levels of mRNA were expressed as ratios to GAPDH.ROZ:rosiglitazone. * P ＜0.05 vs control or ox-LDL.

Group SOCS1 SOCS3 Control 0.18 ±0.03 0.15 ±0.03 ox-LDL 0.30 ±0.04 0.34 ±0.06 LPS 2.95 ±0.34* 1.57 ±0.21*ox-LDL+ROZ(6 h) 2.41 ±0.25* 2.90 ±0.32*ox-LDL+ROZ(12 h) 1.60 ±0.27* 2.42 ±0.37*ox-LDL+ROZ(24 h)0.21 ±0.06 0.44 ±0.15

4 Western blotting 法觀察RAW264.7 源性泡沫細(xì)胞SOCS1 和SOCS3 蛋白的表達

如圖3、4 及表4 所示，control 組與ox-LDL 組只有少量SOCS1 和SOCS3 蛋白的表達，且兩組之間無明顯差別。LPS 作用于泡沫細(xì)胞6 h 及羅格列酮作用于泡沫細(xì)胞6 h、12 h、24 h 后SOCS1 和SOCS3 蛋白的表達均明顯高于control 組與ox-LDL 組(P ＜0.05)。

Figure 3. SOCS1 protein expression in foam cells in different groups detected by Western blotting. Foam cells were treated with 1 mg/L LPS or 100 mg/L ox-LDL for 6 h，or 20 μmol/L rosiglitazone for 6 h，12 h or 24 h.1:control;2:LPS;3 ～5:ox-LDL+rosiglitazone for 6 h，12 h and 24 h;6:ox-LDL.圖3 各組泡沫細(xì)胞SOCS1 蛋白的表達

Figure 4. SOCS3 protein expressions in foam cells in different groups.1:control;2:LPS;3 ～5:ox-LDL+ rosiglitazone for 6 h，12 h and 24 h;6:ox-LDL.圖4 各組泡沫細(xì)胞SOCS3 蛋白的表達

表4 各組泡沫細(xì)胞SOCS1 和SOCS3 蛋白的表達Table 4. SOCS1 and SOCS3 protein expression in foam cells in different groups (±s.n=3)

表4 各組泡沫細(xì)胞SOCS1 和SOCS3 蛋白的表達Table 4. SOCS1 and SOCS3 protein expression in foam cells in different groups (±s.n=3)

The levels of proteins were expressed as ratios to β-actin.ROZ:rosiglitazone. * P ＜0.05 vs control or ox-LDL.

Group SOCS1 SOCS3 Control 0.18 ±0.06 0.15 ±0.06 ox-LDL 0.18 ±0.04 0.09 ±0.05 LPS 1.39 ±0.20* 1.68 ±0.24*ox-LDL+ROZ(6 h) 0.63 ±0.11* 1.20 ±0.13*ox-LDL+ROZ(12 h) 1.40 ±0.18* 1.89 ±0.18*ox-LDL+ROZ(24 h) 0.56 ±0.12* 0.85 ±0.18*

討 論

細(xì)胞因子在動脈粥樣硬化的形成中起著重要的調(diào)節(jié)作用。動脈粥樣硬化患者血清中TNF-α 的濃度比健康對照者明顯增高［5］。血清IL-6 水平可以預(yù)測急性冠脈綜合征病人30 天內(nèi)甚至1 年內(nèi)發(fā)生心血管事件的風(fēng)險［6］。因此，TNF-α 與IL-6 是預(yù)測急性冠狀動脈綜合征的早期基礎(chǔ)病變及嚴(yán)重并發(fā)癥的指標(biāo)。Sumiyoshi 等［7］的研究表明，冠狀動脈粥樣斑塊內(nèi)的IL-10 主要由巨噬細(xì)胞表達，隨著斑塊的進展，IL-10 陽性細(xì)胞的數(shù)量增加，且與oxLDL 的沉積呈正相關(guān)。在不穩(wěn)定型心絞痛病人中，外源性加入IL-10明顯抑制外周血單核細(xì)胞TNF-α 的釋放，雖然IL-10的濃度在急性冠脈綜合征患者中既可不變亦可下降，但其與促炎因子的比值總是下降的［8］。以上研究提示，促炎與抑炎間的失衡可能導(dǎo)致了急性冠脈綜合征的發(fā)生。而IL-10 作為一個有效的抗炎細(xì)胞因子，在調(diào)節(jié)促炎/抗炎平衡、抑制AS 形成中可能起著重要作用。

PPARγ 激動劑對炎癥反應(yīng)的抑制作用已被大量研究證實。研究表明，PPARγ 配體吡格列酮減少了糖尿病大鼠循環(huán)中TNF-α 及IL-6 的生成［9］。本研究結(jié)果表明，小鼠RAW 264.7 細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞在ox-LDL 刺激下分泌TNF-α、IL-6 及IL-10 明顯增多，而羅格列酮抑制了ox-LDL 誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞TNF-α、IL-6 及IL-10 的分泌。這提示ox-LDL 誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞啟動了促炎反應(yīng)的同時，可能有抗炎反應(yīng)負(fù)反饋機制的激活，導(dǎo)致抗炎細(xì)胞因子IL-10 的生成增多。而加入羅格列酮后因為有效抑制了泡沫細(xì)胞的促炎反應(yīng)，其負(fù)反饋機制也相應(yīng)減弱，導(dǎo)致IL-10 的生成減少。本研究同時觀察到，小鼠ox-LDL 誘導(dǎo)的RAW 264.7 細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞TNF-α/IL-10 及IL-6/IL-10比值也明顯增高，而羅格列酮明顯降低這2 個比值，提示羅格列酮可能通過負(fù)反饋機制調(diào)節(jié)了促炎/抗炎反應(yīng)的平衡。

負(fù)向調(diào)控細(xì)胞因子信號的SOCS 蛋白家族與促炎/抗炎反應(yīng)的平衡以及AS 的形成有著密切關(guān)系。Rastmanesh 等［10］的研究表明，終末期腎功能不全患者血中TNF-α、IL-6 及CRP 含量明顯增高，同時伴隨有單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞SOCS1 的表達增多。SOCS3能夠抑制NF-κB 及MAPK 介導(dǎo)的TNF-α 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及JAK-STAT 介導(dǎo)的IL-6 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［11］。T淋巴細(xì)胞SOCS3 缺失促進了IL-10 及IL-17 的生成，促使巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出抗炎癥反應(yīng)的表型，并以IL-17依賴的方式抑制了粥樣斑塊及血管炎癥的進行［12］。Yu 等［13］研究大鼠胰腺炎模型發(fā)現(xiàn)，PPARγ 配體曲格列酮通過誘導(dǎo)SOCS3 表達，抑制JAK2/STAT3 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并進一步抑制IL-6 的表達。

羅格列酮調(diào)節(jié)以上促炎/抗炎反應(yīng)平衡的機制與SOCS 蛋白的表達是否有關(guān)，尚不完全清楚。Park等［14］研究表明，PPARγ 激動劑通過非PPARγ 依賴的途徑誘導(dǎo)了大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞SOCS1 和SOCS3的表達，從而抑制了JAK-STAT 炎癥信號途徑。而與之相反，Lebrun 等［15］的研究表明，PPARγ 配體吡格列酮通過抑制肝臟SOCS3 的表達，抑制了肝臟的炎癥反應(yīng)及胰島素抵抗。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠RAW 264.7 細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞只有很少SOCS1 和SOCS3 表達，而羅格列酮明顯上調(diào)RAW 264.7 細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞SOCS1 和SOCS3 的表達。此結(jié)果與Park 等［14］的研究相似，提示羅格列酮可能通過PPARγ 依賴的途徑同時上調(diào)SOCS1 及SOCS3 的表達，調(diào)節(jié)促炎/抗炎反應(yīng)的平衡。

總之，本研究結(jié)果表明，羅格列酮上調(diào)泡沫細(xì)胞SOCS1 和SOCS3 表達的同時，抑制了泡沫細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6 及IL-10，調(diào)節(jié)了泡沫細(xì)胞促炎/抗炎反應(yīng)的平衡，但尚未揭示出羅格列酮是否直接通過上調(diào)SOCS1 和SOCS3 的表達調(diào)節(jié)了促炎/抗炎反應(yīng)的平衡，需要通過基因敲除或RNA 干擾技術(shù)進一步去驗證。

［1］ Ross R. Atherosclerosis-an inflammatory disease［J］. N Engl J Med，1999，340(2):115-126.

［2］ Hansson GK，Robertson AK，S?derberg-Nauclér C. Inflammation and atherosclerosis［J］. Annu Rev Pathol，2006，1:297-329.

［3］ Ortiz-Munoz G，Martin-Ventura JL，Hernandez-Vargas P，et al. Suppressors of cytokine signaling modulate JAK/STAT-mediated cell responses during atherosclerosis［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2009，29(4):525-531.

［4］ Chen Z，Ishibashi S，Perrey S，et al. Troglitazone inhibits atherosclerosis in apolipoprotein E-knockout mice:pleiotropic effects on CD36 expression and HDL［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2001，21(3):372-377.

［5］ 胡啟程，孫文悅. 動脈粥樣硬化患者血清腫瘤壞死因子的改變及氨氯地平對其影響［J］. 中國實用醫(yī)藥，2008，3(2):15-16.

［6］ Lee KW，Lip GY，Tayebjee M，et al. Circulating endothelial cells，von Willebrand factor，interleukin-6，and prognosis in patients with acute coronary syndromes［J］. Blood，2005，105(2):526-532.

［7］ Sumiyoshi S，Nakashima Y，Chen YX，et al.Interleukin-10 expression is positively correlated with oxidized LDL deposition and inversely with T-lymphocyte infiltration in atherosclerotic intimas of human coronary arteries［J］.Pathol Res Pract，2006，202(3):141-150.

［8］ Waehre T，Halvorsen B，Damas JK，et al. Inflammatory imbalance between IL-10 and TNFα in unstable angina potential plaque stabilizing effects of IL-10［J］. Eur J Clin Invest，2002，32(11):803-810.

［9］ Collino M，Aragno M，Catiglia S，et al. Pioglitazone improves lipid and insulin levels in overweight rats on a high cholesterol and fructose diet by decreasing hepatic inflammation［J］. Br J Pharmacol，2010，160(8):1892-1902.

［10］Rastmanesh MM，Braam B，Joles JA，et al.SOCS expression in peripheral blood mononuclear cells of end stage renal disease patients is related to in.ammation and dialysis modality［J］.Eur J Pharmacol，2009，602(1):163-167.

［11］ Bruuna C，Hedinga PE，Rφnn SG，et al. Suppressor of cytokine signalling-3 inhibits tumor necrosis factor-alpha induced apoptosis and signalling in beta cells［J］. Mol Cell Endocrinol，2009，311(1-2):32-38.

［12］ Taleb S，Romain M，Ramkhelawon B，et al. Loss of SOCS3 expression in T cells reveals a regulatory role for interleukin-17 in atherosclerosis［J］. J Exp Med，2009，206(10):2067-2077.

［13］Yu JH，Kim KH，Kim H. SOCS 3 and PPAR-γ ligands inhibit the expression of IL-6 and TGF-β1 by regulating JAK2/STAT3 signaling in pancreas［J］. Int J Biochem Cell Biol，2008，40(4):677-688.

［14］Park EJ，Park SY，Joe EH，et al. 15d-PGJ2and rosiglitazone suppress Janus kinase-STAT inflammatory signaling through induction of suppressor of cytokine signaling 1(SOCS1)and SOCS3 in glia［J］. J Biol Chem，2003，278(17):14747-14752.

［15］Lebrun P，Van Obberghen E. SOCS proteins causing trouble in insulin action［J］. Acta Physiol (Oxf)，2008，192(1):29-36.