李 飛, 袁 勇, 董吁鋼, 董劍廷, 馮 力, 鄧志華
(1中山市人民醫(yī)院心血管內(nèi)科,廣東 中山528400;2中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科,廣東 廣州510080)
動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是一種炎癥性疾?。?]。其中促炎/抗炎細(xì)胞因子的平衡在AS 的形成以及粥樣斑塊的穩(wěn)定中起著重要作用。細(xì)胞因子在動脈粥樣硬化中的表達量高于在正常動脈中的表達,并且促炎細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)含量高于抗炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素10(interleukin-10,IL-10)[2]。這些研究提示,促炎細(xì)胞因子信號的負(fù)向調(diào)控機制可能在抑制斑塊的進展中起著重要作用。細(xì)胞因子信號抑制物(suppressors of cytokine signaling,SOCS)是一系列能夠抑制細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白。近來發(fā)現(xiàn),SOCS 蛋白家族與AS有著密切關(guān)系。人的動脈粥樣硬化斑塊中巨噬細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞中有SOCS1 及SOCS3 的高表達,且在斑塊炎癥活躍的肩部比纖維化區(qū)表達量要多。反義寡核苷酸技術(shù)靶向下調(diào)ApoE 基因敲除小鼠的SOCS3 基因表達,可通過增加斑塊體積、白細(xì)胞募集及趨化因子表達,促進斑塊的形成[3]。因此,以SOCS 蛋白為靶點,上調(diào)SOCS1 和SOCS3 的表達,減少促炎細(xì)胞因子的生成,可能成為防治AS 的新策略。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors,PPARs)屬于核受體超家族轉(zhuǎn)錄因子。研究表明,PPARγ 的激活能夠抑制動脈粥樣硬化的形成[4]。然而PPARγ 活化對泡沫細(xì)胞SOCS 表達有何影響,尚缺乏充分研究,本研究旨在觀察PPARγ 激動劑羅格列酮對RAW 264.7 細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞促炎/抗炎反應(yīng)以及SOCS1 和SOCS3表達的影響。
小鼠單核-巨噬細(xì)胞株RAW 264.7 購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所生化所。羅格列酮購自Cayman。DMEM 培養(yǎng)基購自Gibco。新生小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)購自廣州威佳科技有限公司。TNF-α、IL-6 及IL-10 ELISA 試劑盒購自晶美生物工程有限公司(最低檢測標(biāo)準(zhǔn)4 ng/L)。小鼠SOCS1 及SOCS3 單克隆抗體購自MBL。
RAW264. 7 細(xì)胞培養(yǎng)于含10% 小牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中,培養(yǎng)條件為37 ℃、95%空氣,5%CO2。每隔2 ~3 d 更換1 次培養(yǎng)液。取對數(shù)生長期細(xì)胞進行實驗,實驗前用倒置顯微鏡觀察,形態(tài)良好,折光性強。細(xì)胞密度調(diào)至2 ×108/L,24 h 后換成含0.1%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng),次日更換1次培養(yǎng)液,加入ox-LDL(100 mg/L)培養(yǎng)24 h 后加入羅格列酮(20 μmol/L)。
實驗分組及分別在加入羅格列酮6 h、12 h、24 h后加入TRIzol Reagent 提取細(xì)胞總RNA,經(jīng)紫外分光光度計檢測純度和濃度。符合要求的總RNA 用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA 第一鏈,以合成的cDNA 為模板,小鼠GAPDH 為內(nèi)參照,小鼠SOCS1 及SOCS3上、下游引物行PCR 檢測。引物由TaKaRa 公司合成,序列:SOCS1 正義鏈5’-AGTAGGATGGTAGCACGCAAC-3’,反義鏈5’-AAGGAACTCAGGTAGTCACGG-3’;SOCS3 正義鏈5’-ACTTCACGGCTGCCAACATC-3’,反義鏈5’-GGATGCGTAGGTTCTTGGTC-3’;GAPDH 正 義 鏈5’-TAGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3’,反義鏈5’-CCCCCAATGTATCCGTTGTG-3’。反應(yīng)體系為50 μL,反應(yīng)條件:95 ℃5 min預(yù)變性,94 ℃30 s,退火(SOCS1:60 ℃;SOCS3:59℃;GAPDH:55 ℃)30 s,72 ℃1 min,40 個循環(huán),72℃7 min。取PCR 擴增產(chǎn)物5 μL 行瓊脂糖凝膠電泳分析,以GAPDH 作內(nèi)參照,計算相對單位。
實驗分組及分別在加入羅格列酮6 h、12 h、24 h后提取細(xì)胞總蛋白:棄去藥物,用預(yù)泠的PBS 潤洗細(xì)胞后,倒盡吸干PBS,加入RIPA 裂解液,冰上裂解30 min,刮下細(xì)胞,離心,取上清液于-80 ℃保存。提取細(xì)胞總蛋白后經(jīng)Mini BCA 法定量。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和免疫印跡雜交:各取12 μL 提取液,100 ℃變性5 min,上樣,電泳,轉(zhuǎn)膜后封閉,加入Ⅰ抗(SOCS1 及SOCS3 抗體濃度1.5 mg/L)4 ℃過夜,洗膜,加入Ⅱ抗(0.5 g/L)于室溫下作用2 h,洗膜后進行化學(xué)發(fā)光,顯影。根據(jù)各條帶密度的變化,判斷SOCS1 及SOCS3 蛋白質(zhì)的表達情況。
實驗分組及加入羅格列酮24 h 后,ELISA 法檢測各組培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6 及IL-10 的含量。操作步驟按試劑盒說明書進行測得各組的A 值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度和相應(yīng)的A 值為參數(shù),用SPSS 10.0 統(tǒng)計軟件進行直線回歸處理,得出相應(yīng)的方程;把各標(biāo)本的A值代入方程算出各標(biāo)本中上述細(xì)胞因子的濃度。
如表1 所示,ox-LDL(100 mg/L)組培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6 及IL-10 的濃度均明顯高于control 組(P <0.05)。而加入羅格列酮(20 μmol/L)24 h 后細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6 及IL-10 的濃度均明顯低于ox-LDL 組(P <0.05)。
表1 各組培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6 及IL-10 的濃度Table 1. The concentrations of TNF-α,IL-6 and IL-10 in supernatants in various groups (ng/L. ±s.n=6)
表1 各組培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6 及IL-10 的濃度Table 1. The concentrations of TNF-α,IL-6 and IL-10 in supernatants in various groups (ng/L. ±s.n=6)
ROZ:rosiglitazone* P <0.05 vs control;#P <0.05 vs ox-LDL.
Group TNF-α IL-6 IL-10 Control 21.17±10.31 16.52±7.00 18.75±8.22 ox-LDL 152.22±49.20* 55.53±10.65* 48.63±10.37*ox-LDL+ROZ 38.32±17.98# 26.75±7.97# 30.16±8.71#
如表2 所示,ox-LDL 組TNF-α/IL-10 及IL-6/IL-10 的比值明顯高于control 組。而加入羅格列酮24 h 后,TNF-α/IL-10 及IL-6/IL-10 的比值明顯低于ox-LDL 組(P <0.05)。
表2 各組培養(yǎng)液中TNF-α/IL-10 和IL-6/IL-10 比值Table 2. TNF-α /IL-10 and IL-6/IL-10 ratios in supernatants in various groups (±s.n=6)
表2 各組培養(yǎng)液中TNF-α/IL-10 和IL-6/IL-10 比值Table 2. TNF-α /IL-10 and IL-6/IL-10 ratios in supernatants in various groups (±s.n=6)
ROZ:rosiglitazone. * P <0. 05 vs control;#P <0. 05 vs ox-LDL.
Group TNF-α/IL-10 IL-6/IL-10 Control 1.10 ±0.21 0.88 ±0.08 ox-LDL 3.07 ±0.40* 1.15 ±0.07*ox-LDL+ROZ 1.23 ±0.25# 0.89 ±0.06#
如圖1、2 及表3 所示,control 組與ox-LDL 組只有少量SOCS1 和SOCS3 mRNA 的表達,且二者之間SOCS1 和SOCS3 mRNA 的表達無明顯差別。而LPS(1 mg/L)作用于泡沫細(xì)胞6 h 及羅格列酮作用于泡沫細(xì)胞6 h、12 h 后SOCS1 和SOCS3 mRNA 表達均明顯高于control 組與ox-LDL 組(P <0.05),24 h 后SOCS1 和SOCS3 mRNA 的表達與control 組及ox-LDL 組無明顯差異(P >0.05)。
Figure 1. SOCS1 mRNA expression in foam cells in different groups detected by RT-PCR. Foam cells were treated with 100 mg/L ox-LDL or 1 mg/L LPS for 6 h,or 20 μmol/L rosiglitazone (ROZ)for 6 h,12 h or 24 h.圖1 各組泡沫細(xì)胞SOCS1 mRNA 的表達
Figure 2. SOCS3 mRNA expressions in foam cells in different groups detected by RT-PCR. Foam cells were treated with 100 mg/L ox-LDL or 1 mg/L LPS for 6 h or 20 μmol/L rosiglitaqzone (ROZ)for 6 h,12 h or 24 h.圖2 各組泡沫細(xì)胞SOCS3 mRNA 的表達
表3 各組泡沫細(xì)胞SOCS1 和SOCS3 mRNA 的表達Table 3. SOCS1 and SOCS3 mRNA expression in foam cells in different groups (±s.n=3)
表3 各組泡沫細(xì)胞SOCS1 和SOCS3 mRNA 的表達Table 3. SOCS1 and SOCS3 mRNA expression in foam cells in different groups (±s.n=3)
The levels of mRNA were expressed as ratios to GAPDH.ROZ:rosiglitazone. * P <0.05 vs control or ox-LDL.
Group SOCS1 SOCS3 Control 0.18 ±0.03 0.15 ±0.03 ox-LDL 0.30 ±0.04 0.34 ±0.06 LPS 2.95 ±0.34* 1.57 ±0.21*ox-LDL+ROZ(6 h) 2.41 ±0.25* 2.90 ±0.32*ox-LDL+ROZ(12 h) 1.60 ±0.27* 2.42 ±0.37*ox-LDL+ROZ(24 h)0.21 ±0.06 0.44 ±0.15
如圖3、4 及表4 所示,control 組與ox-LDL 組只有少量SOCS1 和SOCS3 蛋白的表達,且兩組之間無明顯差別。LPS 作用于泡沫細(xì)胞6 h 及羅格列酮作用于泡沫細(xì)胞6 h、12 h、24 h 后SOCS1 和SOCS3 蛋白的表達均明顯高于control 組與ox-LDL 組(P <0.05)。
Figure 3. SOCS1 protein expression in foam cells in different groups detected by Western blotting. Foam cells were treated with 1 mg/L LPS or 100 mg/L ox-LDL for 6 h,or 20 μmol/L rosiglitazone for 6 h,12 h or 24 h.1:control;2:LPS;3 ~5:ox-LDL+rosiglitazone for 6 h,12 h and 24 h;6:ox-LDL.圖3 各組泡沫細(xì)胞SOCS1 蛋白的表達
Figure 4. SOCS3 protein expressions in foam cells in different groups.1:control;2:LPS;3 ~5:ox-LDL+ rosiglitazone for 6 h,12 h and 24 h;6:ox-LDL.圖4 各組泡沫細(xì)胞SOCS3 蛋白的表達
表4 各組泡沫細(xì)胞SOCS1 和SOCS3 蛋白的表達Table 4. SOCS1 and SOCS3 protein expression in foam cells in different groups (±s.n=3)
表4 各組泡沫細(xì)胞SOCS1 和SOCS3 蛋白的表達Table 4. SOCS1 and SOCS3 protein expression in foam cells in different groups (±s.n=3)
The levels of proteins were expressed as ratios to β-actin.ROZ:rosiglitazone. * P <0.05 vs control or ox-LDL.
Group SOCS1 SOCS3 Control 0.18 ±0.06 0.15 ±0.06 ox-LDL 0.18 ±0.04 0.09 ±0.05 LPS 1.39 ±0.20* 1.68 ±0.24*ox-LDL+ROZ(6 h) 0.63 ±0.11* 1.20 ±0.13*ox-LDL+ROZ(12 h) 1.40 ±0.18* 1.89 ±0.18*ox-LDL+ROZ(24 h) 0.56 ±0.12* 0.85 ±0.18*
細(xì)胞因子在動脈粥樣硬化的形成中起著重要的調(diào)節(jié)作用。動脈粥樣硬化患者血清中TNF-α 的濃度比健康對照者明顯增高[5]。血清IL-6 水平可以預(yù)測急性冠脈綜合征病人30 天內(nèi)甚至1 年內(nèi)發(fā)生心血管事件的風(fēng)險[6]。因此,TNF-α 與IL-6 是預(yù)測急性冠狀動脈綜合征的早期基礎(chǔ)病變及嚴(yán)重并發(fā)癥的指標(biāo)。Sumiyoshi 等[7]的研究表明,冠狀動脈粥樣斑塊內(nèi)的IL-10 主要由巨噬細(xì)胞表達,隨著斑塊的進展,IL-10 陽性細(xì)胞的數(shù)量增加,且與oxLDL 的沉積呈正相關(guān)。在不穩(wěn)定型心絞痛病人中,外源性加入IL-10明顯抑制外周血單核細(xì)胞TNF-α 的釋放,雖然IL-10的濃度在急性冠脈綜合征患者中既可不變亦可下降,但其與促炎因子的比值總是下降的[8]。以上研究提示,促炎與抑炎間的失衡可能導(dǎo)致了急性冠脈綜合征的發(fā)生。而IL-10 作為一個有效的抗炎細(xì)胞因子,在調(diào)節(jié)促炎/抗炎平衡、抑制AS 形成中可能起著重要作用。
PPARγ 激動劑對炎癥反應(yīng)的抑制作用已被大量研究證實。研究表明,PPARγ 配體吡格列酮減少了糖尿病大鼠循環(huán)中TNF-α 及IL-6 的生成[9]。本研究結(jié)果表明,小鼠RAW 264.7 細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞在ox-LDL 刺激下分泌TNF-α、IL-6 及IL-10 明顯增多,而羅格列酮抑制了ox-LDL 誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞TNF-α、IL-6 及IL-10 的分泌。這提示ox-LDL 誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞啟動了促炎反應(yīng)的同時,可能有抗炎反應(yīng)負(fù)反饋機制的激活,導(dǎo)致抗炎細(xì)胞因子IL-10 的生成增多。而加入羅格列酮后因為有效抑制了泡沫細(xì)胞的促炎反應(yīng),其負(fù)反饋機制也相應(yīng)減弱,導(dǎo)致IL-10 的生成減少。本研究同時觀察到,小鼠ox-LDL 誘導(dǎo)的RAW 264.7 細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞TNF-α/IL-10 及IL-6/IL-10比值也明顯增高,而羅格列酮明顯降低這2 個比值,提示羅格列酮可能通過負(fù)反饋機制調(diào)節(jié)了促炎/抗炎反應(yīng)的平衡。
負(fù)向調(diào)控細(xì)胞因子信號的SOCS 蛋白家族與促炎/抗炎反應(yīng)的平衡以及AS 的形成有著密切關(guān)系。Rastmanesh 等[10]的研究表明,終末期腎功能不全患者血中TNF-α、IL-6 及CRP 含量明顯增高,同時伴隨有單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞SOCS1 的表達增多。SOCS3能夠抑制NF-κB 及MAPK 介導(dǎo)的TNF-α 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及JAK-STAT 介導(dǎo)的IL-6 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[11]。T淋巴細(xì)胞SOCS3 缺失促進了IL-10 及IL-17 的生成,促使巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出抗炎癥反應(yīng)的表型,并以IL-17依賴的方式抑制了粥樣斑塊及血管炎癥的進行[12]。Yu 等[13]研究大鼠胰腺炎模型發(fā)現(xiàn),PPARγ 配體曲格列酮通過誘導(dǎo)SOCS3 表達,抑制JAK2/STAT3 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,并進一步抑制IL-6 的表達。
羅格列酮調(diào)節(jié)以上促炎/抗炎反應(yīng)平衡的機制與SOCS 蛋白的表達是否有關(guān),尚不完全清楚。Park等[14]研究表明,PPARγ 激動劑通過非PPARγ 依賴的途徑誘導(dǎo)了大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞SOCS1 和SOCS3的表達,從而抑制了JAK-STAT 炎癥信號途徑。而與之相反,Lebrun 等[15]的研究表明,PPARγ 配體吡格列酮通過抑制肝臟SOCS3 的表達,抑制了肝臟的炎癥反應(yīng)及胰島素抵抗。本研究發(fā)現(xiàn),小鼠RAW 264.7 細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞只有很少SOCS1 和SOCS3 表達,而羅格列酮明顯上調(diào)RAW 264.7 細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞SOCS1 和SOCS3 的表達。此結(jié)果與Park 等[14]的研究相似,提示羅格列酮可能通過PPARγ 依賴的途徑同時上調(diào)SOCS1 及SOCS3 的表達,調(diào)節(jié)促炎/抗炎反應(yīng)的平衡。
總之,本研究結(jié)果表明,羅格列酮上調(diào)泡沫細(xì)胞SOCS1 和SOCS3 表達的同時,抑制了泡沫細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6 及IL-10,調(diào)節(jié)了泡沫細(xì)胞促炎/抗炎反應(yīng)的平衡,但尚未揭示出羅格列酮是否直接通過上調(diào)SOCS1 和SOCS3 的表達調(diào)節(jié)了促炎/抗炎反應(yīng)的平衡,需要通過基因敲除或RNA 干擾技術(shù)進一步去驗證。
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