鄧 佳， 鄧偉平， 鐘 誠， 胡 彬， 王一鳴△

1型神經(jīng)纖維瘤(type 1 neurofibromatosis)是最常見的常染色體顯性遺傳病之一，在人群中的發(fā)病率為1/2 500～1/3 000［1］。主要臨床表現(xiàn)為皮膚及皮下神經(jīng)纖維瘤、咖啡斑和虹膜錯構(gòu)瘤(Lisch結(jié)節(jié))。部分患者可具有面容異常及智力低下［2-3］或并發(fā)神經(jīng)膠質(zhì)瘤［4-5］、惡性周圍神經(jīng)鞘瘤等［6］。神經(jīng)纖維瘤1(neurofibromatosis 1，NF1;MIM ID:613113)基因是本病的致病基因，定位于染色體17q11.2，含58個編碼外顯子，有3種剪接方式，其最長的轉(zhuǎn)錄亞型編碼2 839個氨基酸的蛋白質(zhì)，外顯率接近100%?，F(xiàn)已報道的NF1基因突變類型呈多樣化，堿基置換、剪切位點突變、小片段的插入和缺失、大片段的缺失、插入及重復(fù)、復(fù)雜的重排、拷貝數(shù)目變異等均有報道，其中關(guān)于拷貝數(shù)目變異的報道僅限于非中國人群，我國尚未見這一變異的報道。約50%的病例為自發(fā)突變所致［7］，是人類基因中突變率最高的基因之一。

近年來隨著新一代測序技術(shù)的迅猛發(fā)展，對每一例腫瘤病人進(jìn)行測序，獲得其致病性突變，從而進(jìn)行個體化治療［8］，這已成為部分西方國家的腫瘤研究/治療途徑。本研究中，我們對2例病人的NF1基因進(jìn)行分析檢測，發(fā)現(xiàn)一例國際上未報道的新突變，并首次在國內(nèi)報道了另一例患者NF1基因的拷貝數(shù)目變異。

材料和方法

1 研究對象

2例1型神經(jīng)纖維瘤的病人均來自于廣東省人民醫(yī)院皮膚科，他們的父母及50例正常對照的血樣也來自于廣東省人民醫(yī)院。本研究得到了研究對象及患者家屬的知情同意和中山大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

患者S736出生時即發(fā)現(xiàn)軀干、四肢有散發(fā)的咖啡斑。5歲開始腹部出現(xiàn)散在的皮膚或皮下神經(jīng)纖維瘤。大小不一，指壓瘤體似海綿狀并呈局部凹陷，松開手指即恢復(fù)原狀，同時伴有色素沉著斑，但一直無自覺癥狀。隨著年齡增長，皮損波及軀干四肢。患者的智力、身體發(fā)育均正常，不伴有眼睛及周圍神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。另一患者S743出生時即出現(xiàn)了與患者S736相似的皮膚表現(xiàn)，此外還于幼年期出現(xiàn)了腰椎右側(cè)彎曲，認(rèn)知能力較差，以致不能完成初中學(xué)業(yè)并最后綴學(xué)，患者于19歲死于腦膠質(zhì)瘤。按NIH標(biāo)準(zhǔn)［9］，兩患者均診斷為1型神經(jīng)纖維瘤，兩患者的父母經(jīng)詳細(xì)的臨床檢查未發(fā)現(xiàn)異常。

2 方法

2.1 基因組DNA提取 抽取患者及其父母和50例正常對照外周血2 mL，乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝，按 Qiagen 基因組小量抽提試劑盒指南提取DNA。

2.2 引物設(shè)計及PCR 從數(shù)據(jù)庫UCSC Human Genome Browser(http://genome.ucsc.edu)(GRCh37/hg19)提取NF1基因的序列 (NG_009018.1)，利用Oligo 6.0(http://www.oligo.net/downloads.html)自行設(shè)計能夠擴(kuò)增基因編碼區(qū)域及剪切位點的引物，并由上海生工生物公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為30μL標(biāo)準(zhǔn)體系，反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min;95℃30 s，退火 45 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán);72 ℃ 10 min。

2.3 PCR產(chǎn)物測序及突變鑒定 對PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測序，所用試劑為Big Dye Terminator 3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)，在 ABI 3730XL DNA自動測序儀進(jìn)行。對測序結(jié)果用Sequence Scanner 1.0軟件(ABI)分析，所得序列與UCSC數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。堿基變異按den Dunnen以及Antonarakis(http://www.hgvs.org/mutnomen/)命 名 法則［10］。對所發(fā)現(xiàn)的遺傳變異與人類基因突變數(shù)據(jù)庫(the Human Gene Mutation Database，HGMD;http://www.hgmd.org/)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，并查詢PubMed上已發(fā)表的文獻(xiàn)確定所檢突變是否為新突變。突變根據(jù)以下參考序列命名:GenBank NM_001042492.2 和 GenBank NP_001035957.1。

2.4 多重連接探針擴(kuò)增技術(shù) 在測序中對于未發(fā)現(xiàn)突變的患者S743，我們推測為NF1拷貝數(shù)目改變所致，故進(jìn)一步采用了多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)進(jìn)行分析。為了排除多重突變的情況，我們對已發(fā)現(xiàn)突變的病人S736也進(jìn)行了此分析。MLPA 1型神經(jīng)纖維瘤檢測試劑盒購自MRC-Holland，外顯子區(qū)域及邊界區(qū)域探針包含在以下3組探針盒中:SALSA P081、P082和P122。實驗流程按MDA-002版本MLPA說明書進(jìn)行操作，產(chǎn)物經(jīng)ABI 3730XL DNA自動測序儀電泳后，對獲得的GeneMapper數(shù)據(jù)用Coffalyser軟件進(jìn)行分析。

2.5 長片段PCR 由于MLPA實驗提示患者S743存在NF1基因的大片段缺失，我們根據(jù)MLPA檢測的結(jié)果，結(jié)合國際上已報道的NF1 3個常見缺失片段的斷裂部分，合成了長片段PCR引物(表1)，并進(jìn)行相應(yīng)的PCR反應(yīng)。

表1 檢測斷裂點的長片段PCR引物序列Table 1.Primers used for the long range PCR to detect the breakpoint

結(jié) 果

1 突變檢測結(jié)果

正反向測序證實病人S736在NF1基因中存在1 個新突變:c.6345_6346 ins G(p.Leu2116Alafs*4)，見圖1A。該突變造成開放閱讀框架的移位，在肽鏈第2 119位引入終止密碼子，從而使3’端721個氨基酸被截斷，丟失了野生型蛋白中犰狳式褶皺(ARM-type fold)結(jié)構(gòu)域C末端的一部分(InterPro，http://www.ebi.ac.uk/interpro/)，見圖 2。SIFT 預(yù)測，此突變還可引起無義突變介導(dǎo)的mRNA降解(nonsense mediated decay，NMD)，導(dǎo)致含該突變的等位基因無實際上的表達(dá)。此突變經(jīng)3次以上正反向驗證。HGMD檢索并未發(fā)現(xiàn)此突變的報道，故為一新突變，50例無血緣關(guān)系的正常人中未發(fā)現(xiàn)同樣突變。獲此結(jié)果后，我們進(jìn)一步對其父母進(jìn)行這一突變的檢測，未發(fā)現(xiàn)異常，見圖1B、C，故此突變?yōu)橐籨e novo突變。病人S743在NF1基因的編碼外顯子及其側(cè)翼序列未發(fā)現(xiàn)突變。

Figure 1.Partial sequencing results of patient S736(A)and her parents(B，C).Arrows indicate the insertion of G in patient S736 and the wild C in her parents.圖1 患者S736及其父母的部分測序圖結(jié)果

2 MLPA結(jié)果

病人S743 MLPA檢測結(jié)果提示1.3～1.9 Mb缺失(圖3)，缺失片段涵蓋整個NF1基因及其部分5’和3’端的側(cè)翼部分。病人S736 MLPA檢測未見異常。

Figure 2.Mutant NF1 protein of patient S736.The wild-type NF1 protein has an armadillo(ARM)-type fold domain(green)and two domains:Ras-GAP(red)，CRALTRIO(blue).Arrow denotes the truncating point of the mutation p.Leu2116Alafs*4，which would result in the loss of part of the ARM-type fold.圖2 患者S736的突變NF1蛋白

Figure 3.The MLPA results showed a 1.3 ～1.9 Mb deletion in patient S743.A:patient S743.Probes with* (red)show the heterozygous deletion positions.B:normal control.圖3 患者S743的MLPA結(jié)果顯示有1.3～1.9 Mb缺失

3 長片段PCR

長片段PCR未獲得任何特異性擴(kuò)增片段，提示這一病例的缺失可能存在不同于以往報道的斷裂點。

討 論

本研究先對2例1型神經(jīng)纖維瘤患者進(jìn)行了NF1基因的突變篩查。通過對PCR產(chǎn)物直接測序的方法，在患者S736中發(fā)現(xiàn)了NF1基因新生突變c.6345_6346 ins G(p.Leu2116Alafs*4)，HGMD 檢索證明該突變?yōu)橐粋€新突變。此后，對2個病人進(jìn)行了MLPA檢測，病人S743檢測到整個NF1基因的缺失和5’和3’端側(cè)翼序列的缺失，且缺失區(qū)域在1.3～1.9 Mb范圍內(nèi)，文獻(xiàn)檢索證明這是國內(nèi)第一次用MLPA對NF1基因進(jìn)行檢測，也是首次中國人整個NF1基因缺失的報道。

p.Leu2116Alafs*4使NF1蛋白的第2 116位氨基酸由亮氨酸變成丙氨酸，并且由于堿基的插入導(dǎo)致了密碼子的框移，在突變位點后的第3個密碼子處出現(xiàn)終止密碼子從而使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)截斷，p.Leu2116Alafs*4位于 ARM-type fold結(jié)構(gòu)域。ARM-type fold是一個多超螺旋褶皺，由2弧層α螺旋排列在一個常規(guī)的右手超螺旋中，這種結(jié)構(gòu)提供了一個廣泛的溶劑表面，很適合與底物如蛋白質(zhì)和核酸結(jié)合。p.Leu2116Alafs*4突變截斷了野生型蛋白質(zhì)中的部分ARM-type fold結(jié)構(gòu)域(圖2)，可能影響它的超螺旋結(jié)構(gòu)從而影響NF1蛋白與DNA或蛋白質(zhì)的結(jié)合及相互作用，最終導(dǎo)致功能的喪失;且由于無義突變介導(dǎo)的mRNA降解，此突變不存在轉(zhuǎn)錄蛋白，相當(dāng)于等位基因缺失。該患者父母體格檢查正常，皮膚黏膜未發(fā)現(xiàn)異常，且突變篩查結(jié)果陰性，說明該患者的突變是de novo突變，50例正常對照的篩查也排除了多態(tài)性的可能，因此本研究所發(fā)現(xiàn)的NF1 de novo突變是引起1型神經(jīng)纖維瘤的致病性突變。

1型神經(jīng)纖維瘤病人中，約5%［11］病人存在大片段的NF1基因缺失。患者S743經(jīng)MLPA檢測提示其存在含整個NF1基因的一段1.3～1.9 Mb的缺失，非等位基因同源重組被認(rèn)為是導(dǎo)致大片段缺失發(fā)生的最常見原因，國外研究已發(fā)現(xiàn)3個重組熱點:1.4 Mb的缺失稱為1型，是大片段缺失最常見的一型，斷裂點主要位于 NF1-REPs A 和 C［12-13］;1.2 Mb的缺失稱為2型，斷裂點位于SUZ12和它的假基因SUZ12P 內(nèi)［14］;1.0 Mb的缺失稱為3 型，斷裂點位于NF1-REPs B 和 C［3，15］。大片段的 NF1 缺失經(jīng)常與嚴(yán)重疾病表型相關(guān)，如先天性面部畸形、智力缺陷及對惡性腫瘤易感性高。S743患者于19歲患腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤而死亡，屬重型1型神經(jīng)纖維瘤患者，這顯然與它缺失NF1基因相關(guān)。NF1基因是一個腫瘤抑制基因，它能下調(diào)原癌基因ras的活性［16］。由于我們針對3個常見斷裂點的長片段PCR未獲得陽性結(jié)果，此患者可能含有新的不常見的斷裂點，目前我們對于S743患者的斷裂點研究仍在進(jìn)行中。

［1］ Williams VC，Lucas J，Babcock MA，et al.Neurofibromatosis type 1 revisited［J］.Pediatrics，2009，123(1):124-133.

［2］ Mautner VF，Kluwe L，F(xiàn)riedrich RE，et al.Clinical characterisation of 29 neurofibromatosis type-1 patients with molecularly ascertained 1.4 Mb type-1 NF1 deletions［J］.J Med Genet，2010，47(9):623-630.

［3］ Pasmant E，Sabbagh A，Spurlock G，et al.NF1 microdeletions in neurofibromatosis type 1:from genotype to phenotype［J］.Hum Mutat，2010，31(6):E1506-E1518.

［4］ Thiagalingam S，F(xiàn)laherty M，Billson F，et al.Neurofibromatosis type 1 and optic pathway gliomas:follow-up of 54 patients［J］.Ophthalmology，2004，111(3):568-577.

［5］ Graf N.Glioblastoma in children with NF1:the need for basic research［J］.Pediatr Blood Cancer，2010，54(7):870-871.

［6］ McCaughan JA，Holloway SM，Davidson R，et al.Further evidence of the increased risk for malignant peripheral nerve sheath tumour from a Scottish cohort of patients with neurofibromatosis type 1 ［J］.J Med Genet，2007，44(7):463-466.

［7］ Lázaro C，Ravella A，Gaona A，et al.Neurofibromatosis type 1 due to germ-line mosaicism in a clinically normal father［J］.N Eng J Med，1994，331(21):1403-1407.

［8］ Hezel AF，Deshpande V，Zhu AX.Genetics of biliary tract cancers and emerging targeted therapies［J］.J Clin Oncol，2010，28(21):3531-3540.

［9］ National Institutes of Health Consensus Development Conference.Neurofibromatosis:conference statement［J］.Arch Neurol，1988，45(5):575-578.

［10］ den Dunnen JT，Antonarakis SE.Mutation nomenclature extensions and suggestions to describe complex mutations:a discussion ［J］.Hum Mutat，2000，15(1):7-12.

［11］ Kluwe L，Siebert R，Gesk S，et al.Screening 500 unselected neurofibromatosis 1 patients for deletions of the NF1 gene［J］.Hum Mutat，2004，23(2):111-116.

［12］ De Raedt T，Stephens M，Heyns I，et al.Conservation of hotspots for recombination in low-copy repeats associated with the NF1 microdeletion ［J］.Nat Genet，2006，38(12):1419-1423.

［13］Forbes SH，Dorschner MO，Le R，et al.Genomic context of paralogous recombination hotspots mediating recurrent NF1 region microdeletion ［J］.Genes Chrom Cancer，2004，41(1):12-25.

［14］ Petek E，Jenne DE，Smolle J，et al.Mitotic recombination mediated by the JJAZ1(KIAA0160)gene causing somatic mosaicism and a new type of constitutional NF1 microdeletion in two children of a mosaic female with only few manifestations［J］.J Med Genet，2003，40(7):520-525.

［15］ Bengesser K，Cooper DN，Steinmann K，et al.A novel third type of recurrent NF1 microdeletion mediated by nonallelic homologous recombination between LRRC37B-containing low-copy repeats in 17q11.2 ［J］.Hum Mutat，2010，31(6):742-751.

［16］ Trovó-Marqui AB，Tajara EH.Neurofibromin:a general outlook ［J］.Clin Genet，2006，70(1):1-13.