宋海巖， 鄧曉慧， 孫春莉

食管癌是目前全球發(fā)病率、死亡率最高的惡性腫瘤之一，晚期食管鱗癌主要治療手段是化療，順鉑(cisplatin，DDP)是食管鱗癌治療最常用的化療藥物之一，但是DDP的副作用較大且易出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞耐藥等情況，限制了其臨床應(yīng)用及療效。食管癌相關(guān)基因2(esophageal cancer-related gene 2，ECRG2)或絲氨酸轉(zhuǎn)肽酶抑制劑Kazal type 7(serine peptidase inhibitor，Kazal type 7，SPINK7)是 Su 等［1］在 1998 年利用mRNA差異顯示技術(shù)在正常食管組織和來自林縣的3對高癌家族中分離與鑒定的新基因(Gen-Bank:AF268198)。體內(nèi)外實驗均證實，ECRG2蛋白能抑制腫瘤細(xì)胞生長，促進(jìn)凋亡［2］。本實驗通過觀察ECRG2蛋白單用或與DDP聯(lián)用時對人食管癌EC9706細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為ECRG2蛋白聯(lián)合化療藥物用于抗腫瘤提供理論依據(jù)。

材料和方法

1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

人食管癌EC9706細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞庫)在含有10%胎牛血清、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實驗細(xì)胞均處于對數(shù)生長期。設(shè)正常細(xì)胞組、ECRG2蛋白組(其終濃度分別為5.5 μg/L、6.5 μg/L、7.5 μg/L 和 8.5 μg/L)和 ECRG2 蛋白+順鉑組(順鉑終濃度為3 mg/L)。

2 試劑

ECRG2蛋白(上海生工)，順鉑(齊魯制藥)，RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(HyClone)，噻唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞砜(DMSO，Sigma)，細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(碧云天)，兔抗p53抗體(Abcam)。

3 EC9706細(xì)胞體外增殖抑制實驗

采用MTT法，取對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整其濃度為4×107/L，接種于96孔板，每孔體積200 μL，待細(xì)胞貼壁后，ECRG2蛋白組分別加入終濃度為5.5 μg/L、6.5μg/L、7.5 μg/L 和 8.5 μg/L 的 ECRG2 蛋白，ECRG2蛋白+順鉑組在以上各ECRG2蛋白組基礎(chǔ)上加入終濃度為3 mg/L的順鉑，另設(shè)不加藥物的正常細(xì)胞組，每個濃度均設(shè)10個復(fù)孔。分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，于終止前4 h，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h后棄去上清液，加入150μL DMSO，輕輕振蕩10 min，使結(jié)晶物完全溶解，在酶聯(lián)分析儀上490 nm波長處測吸光度值(A值)。

4 Hoechst 33258染色法檢測細(xì)胞凋亡

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整其濃度為4×107/L，接種于6孔板(內(nèi)置載玻片)，貼壁后按上述給藥濃度分組加藥，加藥后各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h，取出細(xì)胞爬片，按試劑盒操作步驟進(jìn)行處理，光鏡下觀察凋亡細(xì)胞并計數(shù)。染色后細(xì)胞核呈白色的細(xì)胞被判為凋亡細(xì)胞。隨機(jī)選取6個高倍鏡視野，分別計數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計算細(xì)胞凋亡率。

5 Western blotting檢測凋亡相關(guān)蛋白p53的表達(dá)

細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，依次進(jìn)行蛋白提取、定量(加細(xì)胞裂解液裂解、BCA法測定蛋白質(zhì)濃度)，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉液封閉2 h，加Ⅰ抗4℃過夜，TBST洗10 min×3次，加Ⅱ抗(1∶2 000)37 ℃孵育1 h，TBST洗 10 min×3次，按照ECL試劑盒說明進(jìn)行顯色、曝光。

6 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，均數(shù)比較采用單因素方差分析，應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ECRG2蛋白與DDP對EC9706細(xì)胞體外增殖的影響

不同濃度ECRG2蛋白對EC9706細(xì)胞生長均有抑制作用，其抑制率呈一定的時間和濃度依賴性;不同濃度 ECRG2蛋白與3 mg/L DDP聯(lián)用后，抑制EC9706細(xì)胞增殖作用增強(P＜0.01)，隨著ECRG2蛋白濃度及時間增加，EC9706細(xì)胞增殖率顯著降低，呈一定的時間、濃度依賴性，見表1。

表1 ECRG2蛋白及ECRG2蛋白聯(lián)合DDP作用不同時間對EC9706細(xì)胞增殖的影響Table 1.Effects of ECRG2 protein and ECRG2 protein combined with DDP on EC9706 cell proliferation at different time points(%.Mean±SD.n=24)

2 ECRG2蛋白與DDP對EC9706細(xì)胞凋亡的影響

Hoechst 33258染色后，凋亡細(xì)胞多表現(xiàn)為胞體縮小、變圓，核濃縮，呈白色。ECRG2蛋白單用時，細(xì)胞凋亡率與正常對照組比差異顯著，呈一定的量效關(guān)系;ECRG2蛋白和DDP聯(lián)合應(yīng)用時，隨ECRG2蛋白濃度增加EC9706細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯增加(P＜0.01)，呈劑量依賴關(guān)系，見圖1、表2。

Figure 1.Effects of ECRG2 protein combined with DDP for 24 h on EC9706 cell apoptosis.A:normal control group;B:ECRG2 protein(8.5 μg/L)group;C:ECRG2 protein+DDP(8.5 μg/L+3 mg/L)group.圖1 ECRG2蛋白聯(lián)合DDP作用24 h后對EC9706細(xì)胞凋亡的影響

3 ECRG2蛋白與DDP對凋亡相關(guān)蛋白p53表達(dá)的影響

不同濃度ECRG2蛋白均可促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白p53的表達(dá)，與正常對照組比差異顯著(P＜0.01)，呈劑量依賴關(guān)系;ECRG2蛋白和DDP聯(lián)合應(yīng)用時，隨著ECRG2蛋白濃度增加，與單用ECRG2蛋白組相比，EC9706細(xì)胞中p53蛋白的表達(dá)明顯增加(P＜0.01)，見圖 2。

表2 ECRG2蛋白聯(lián)合DDP作用24 h后對EC9706細(xì)胞凋亡的影響Table 2.Effects of ECRG2 protein combined with DDP for 24 h on EC9706 cell apoptosis(%.Mean±SD.n=24)

Figure 2.Expression of p53 detected by Western blotting.A:normal control group;B:ECRG2 protein(5.5 μg/L);C:ECRG2 protein(6.5 μg/L);D:ECRG2 protein(7.5 μg/L);E:ECRG2 protein(8.5 μg/L);F:ECRG2 protein+DDP(5.5 μg/L+3 mg/L);G:ECRG2 protein+DDP(6.5 μg/L+3 mg/L);H:ECRG2 protein+DDP(7.5 μg/L+3 mg/L);I:ECRG2 protein+DDP(8.5 μg/L+3 mg/L).Mean±SD.n=24.＊＊P ＜ 0.01 vs control;##P ＜ 0.01 vs ECRG2 protein at the same dose.圖2 Western blotting檢測凋亡相關(guān)蛋白p53的表達(dá)

討 論

食管癌是目前全球發(fā)病率、死亡率最高的惡性腫瘤之一，且預(yù)后極差［3-4］，中晚期患者5年生存率僅為10%左右。化療作為食管癌綜合治療的重要手段，順鉑是治療食管癌常用的化療藥物之一，其主要是通過誘導(dǎo)DNA損傷殺傷腫瘤細(xì)胞［5-6］，順鉑導(dǎo)致的DNA損傷可以通過激活多種信號通路而激活細(xì)胞凋亡信號，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但由于其嚴(yán)重的毒性作用，如骨髓抑制、腎臟損傷和神經(jīng)毒性等，使其臨床應(yīng)用受到一定的限制。因此，臨床上主張聯(lián)合用藥，即可提高治療效果，又能降低鉑類為主的化療藥物的臨床用量，減低其毒副作用。

ECRG2定位于5q32～33，全長3 540 bp，由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成。ECRG2 cDNA全長569 bp，含有一個258 bp的完整編碼框，編碼一個85個氨基酸殘基的多肽。RT-PCR分析顯示ECRG2 mRNA在食管及多種正常組織中表達(dá)，但在食管癌組織中表達(dá)明顯下調(diào)［7］。體內(nèi)、體外實驗均證實，ECRG2能抑制腫瘤細(xì)胞生長、增殖，促進(jìn)凋亡［2，8-9］。細(xì)胞內(nèi)，ECRG2通過調(diào)控p53轉(zhuǎn)錄活性及中心體定位能力，參與中心體復(fù)制調(diào)控。ECRG2基因缺失導(dǎo)致中心體復(fù)制異常、多極紡錘體出現(xiàn)，最終導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定性、非整倍體腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)［10］。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是腫瘤增殖和分化異常及腫瘤細(xì)胞凋亡異常的結(jié)果，大多數(shù)抗腫瘤藥物都能誘導(dǎo)敏感腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，其抗腫瘤效能與腫瘤細(xì)胞在藥物誘導(dǎo)下發(fā)生細(xì)胞凋亡的活性有關(guān)。因此，誘導(dǎo)瘤細(xì)胞凋亡成為腫瘤治療的一個新熱點，評價療效的一項新指標(biāo)［11］。本實驗MTT結(jié)果顯示ECRG2蛋白對食管癌EC9706細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，隨ECRG2蛋白濃度及時間增加EC9706細(xì)胞增殖率顯著降低，呈一定的時間劑量依賴效應(yīng)關(guān)系;Hoechst染色結(jié)果顯示ECRG2蛋白可誘導(dǎo)食管癌EC9706細(xì)胞凋亡，促使食管癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

p53是由393個氨基酸組成的轉(zhuǎn)錄因子，其與DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡及腫瘤抑制密切相關(guān)［12-14］。p53基因突變在惡性腫瘤的形成與發(fā)展中發(fā)揮重要作用［15-16］。研究表明，ECRG2不僅可上調(diào)p53蛋白的表達(dá)，且可影響其轉(zhuǎn)錄活性，ECRG2基因轉(zhuǎn)染可干擾人食管癌細(xì)胞的正常生長，抑制其增殖，并可通過上調(diào)p53發(fā)揮其作用［17］。本實驗Western blotting結(jié)果顯示，不同濃度ECRG2蛋白均可促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白p53的表達(dá)，ECRG2蛋白和DDP聯(lián)合應(yīng)用時，隨著ECRG2蛋白濃度增加，EC9706細(xì)胞中p53蛋白的表達(dá)明顯增加，呈劑量依賴關(guān)系。

本實驗中，DDP與EDRG2蛋白聯(lián)合應(yīng)用時，其抑制食管癌EC9706細(xì)胞細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡的效應(yīng)及促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白p53的表達(dá)明顯強于單獨用藥時的效應(yīng)，且隨著藥物濃度增加，其效應(yīng)也相應(yīng)增加，提示ECRG2蛋白和順鉑聯(lián)合用藥比ECRG2蛋白單獨用藥效果明顯。ECRG2蛋白和順鉑聯(lián)用還可以降低順鉑的藥物用量，減少順鉑的毒副作用，達(dá)到較好的治療效果。

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