梅愛紅， 劉俊許， 陳思鋒， 孟 丹△

高胰島素血癥是2型糖尿病胰島素抵抗的特征 之一。研究表明，高于生理濃度的胰島素(insulin)可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，在糖尿病病人動(dòng)脈粥樣硬化和血管成形術(shù)后再狹窄的發(fā)生和發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用［1］。

活性氧(reactive oxygen species，ROS)是反應(yīng)活性極強(qiáng)的代謝分子，主要包括超氧自由基(O－·2)、過氧化氫(H2O2)和羥自由基(·OH)。雖然過多的ROS會(huì)引起細(xì)胞的衰老和凋亡［2-3］，但是低水平的ROS可作為許多刺激因子的第二信使，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種功能［4］。我們以往研究發(fā)現(xiàn)，ROS參與了胰島素樣生長(zhǎng)因子I(insulin-like growth factor I，IGFI)引起的血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移［5-6］。研究表明，胰島素促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞 ROS的產(chǎn)生［7］，但是ROS在胰島素引起的血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移中的作用和分子機(jī)制還不十分清楚。本文中我們研究了ROS在胰島素促進(jìn)的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達(dá)及血管平滑肌細(xì)胞遷移和增殖中的作用，為臨床尋找有效的抗動(dòng)脈粥樣硬化干預(yù)靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材料

8周齡健康雄性SD大鼠(Sprague-Dawley rats，體重約150 g)由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰酶購(gòu)于Invitrogen。2’，7’-二氯熒光素二乙酸酯(2’，7’-dichlorofluorescein diacetate，DCF-DA)購(gòu)于 Molecular Probes。胰島素(insulin)、過氧化氫酶(catalase)、NADPH氧化酶抑制劑二亞苯基碘鎓(diphenylene iodonium，DPI)和夾竹桃麻素(apocynin)購(gòu)于Sigma。抗大鼠p-ERK 1/2和 ERK2抗體購(gòu)于 Santa Cruz，抗大鼠 p-Akt、Akt、p70 S6 激酶 1(p70 S6 kinase 1，p70S6K1)和p-p70S6K1購(gòu)于Cellular Signaling。大鼠VEGF酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。SYBR Green購(gòu)于Bio-Rad。CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所。

2 大鼠血管平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)

無(wú)菌操作取出SD大鼠胸主動(dòng)脈，分離中膜平滑肌組織，用DMEM培養(yǎng)液洗滌3次，剝?nèi)ソY(jié)締組織與外膜，縱軸剖開，剝除內(nèi)膜，剪切成1 mm×1 mm×1 mm方塊，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中。加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，每周更換培養(yǎng)液1次，20 d后可見平滑肌細(xì)胞自移植塊邊緣長(zhǎng)出并形成致密單層時(shí)，即開始傳代培養(yǎng)，之后的傳代培養(yǎng)用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液。平滑肌細(xì)胞通過形態(tài)學(xué)和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)免疫組化方法鑒定。實(shí)驗(yàn)選用第3～6代細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)共分4組，分別是:對(duì)照組、胰島素組、胰島素+過氧化氫酶catalase組、胰島素+NADPH氧化酶抑制劑DPI組。

3 細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測(cè)

細(xì)胞內(nèi)ROS水平采用DCF-DA熒光探針法檢測(cè)。將細(xì)胞種于6孔板中，無(wú)血清處理12 h后，用catalase(1.5 ×106U/L)、DPI(5 μmol/L)或 apocynin(20 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞30 min，然后加入胰島素(100 nmol/L)處理細(xì)胞5 min，再加入 DCF-DA(5 μmol/L)避光37℃孵育15 min。細(xì)胞用PBS洗3次后，消化細(xì)胞成懸液，用流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter)檢測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)480 nm，發(fā)射波長(zhǎng)540 nm。

4 蛋白免疫印跡

血管平滑肌細(xì)胞無(wú)血清處理后，預(yù)處理catalase(1.5 ×106U/L)和 DPI(5 μmol/L)30 min，加入胰島素(100 nmol/L)孵育30 min，然后裂解細(xì)胞，離心后取上清。用蛋白測(cè)定試劑盒(Bio-Rad)檢測(cè)蛋白濃度。蛋白上樣量50 μg，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜、5%脫脂牛奶封閉1 h后分別加 p-Akt、Akt、p-p70S6K1、p70S6K1、p-ERK 1/2和ERK2抗體(1∶1 000)，4℃孵育過夜;TBST洗3次，加上HRP標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶3 000)，室溫孵育1 h 30 min，TBST洗4次后進(jìn)行ECL顯色發(fā)光。X光膠片用ImageJ圖像分析軟件進(jìn)行蛋白定量分析。

5 實(shí)時(shí)定量PCR

收集細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas)說明書采用隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(Bio-Rad)，以SYBR Green為熒光探針，在real-time analyzer(Bio-Rad)儀器上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)并分析結(jié)果，以GAPDH作為內(nèi)參照。引物序列如下:VEGF164上游引物 5’-ATCTTCAAGCCGTCCTGTGTGC-3’，下游引物 5’-CAAGGCTCACAGTGAACGCT-3’;GAPDH 上游引物5’-CCATCTTCCAGGAGCGAGATC-3’，下游引物 5’-GCCTTCTCCATGGTGGTGAA-3’。

6 報(bào)告基因熒光素酶檢測(cè)

按照Invitrogen公司說明書，用脂質(zhì)體(Lipofectamine 2000)轉(zhuǎn)染的方法，將含有VEGF啟動(dòng)子片段(2.4 kb)的報(bào)告基因和β-半乳糖質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到血管平滑肌細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒pGL2為空白對(duì)照。轉(zhuǎn)染24 h后，細(xì)胞無(wú)血清處理12 h，用catalase(1.5×106U/L)和 DPI(5 μmol/L)預(yù)處理細(xì)胞 30 min，然后加入胰島素(100 nmol/L)孵育20 h，制備細(xì)胞裂解物。按照螢光素酶報(bào)告基因分析系統(tǒng)(Luciferase Reporter Assay System;Promega)的說明書，在螢光素酶報(bào)告分析儀上檢測(cè)裂解物的螢光值。β-半乳糖酶活性的檢測(cè)是將裂解物與β-半乳糖酶檢測(cè)底物在37℃孵育1 h，然后置于酶標(biāo)儀上，在420 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度值。螢光素酶報(bào)告基因的螢光值與內(nèi)參照β-半乳糖酶活性的比值即代表所檢測(cè)的VEGF啟動(dòng)子片段的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。

7 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)培養(yǎng)上清中VEGF水平

細(xì)胞預(yù)處理catalase或DPI，加入胰島素孵育24 h后收集培養(yǎng)上清，上清中 VEGF的含量用大鼠VEGF ELISA試劑盒檢測(cè)，按照說明書步驟進(jìn)行。通過VEGF的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算上清中VEGF的含量，并用細(xì)胞蛋白含量作校正，以ng/(g protein)表示。

8 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞種于培養(yǎng)皿中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%以上時(shí)，用無(wú)菌槍頭在培養(yǎng)皿底部作直線劃痕，PBS洗后將劃痕處拍照作為初始對(duì)照，然后加入catalase或DPI，并與胰島素孵育。24 h后顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野進(jìn)行拍照，與初始劃痕比較，測(cè)量劃痕兩邊細(xì)胞遷移的距離，取均值。

9 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞預(yù)處理catalase或DPI，加入胰島素孵育24 h后將加有藥物的培養(yǎng)液吸出，加入含CCK-8的培養(yǎng)液，CCK-8與培養(yǎng)液的體積比例為1∶10，放置37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm吸光度。

10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，兩組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析(One-way ANOVA)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 胰島素通過NADPH氧化酶途徑促進(jìn)ROS產(chǎn)生

如圖1所示，胰島素處理血管平滑肌細(xì)胞5 min后，ROS水平與對(duì)照組相比明顯升高(P＜0.05)，catalase、DPI或 apocynin處理后，與胰島素組相比ROS水平明顯下降(P＜0.01)，提示胰島素通過NADPH氧化酶途徑促進(jìn)ROS產(chǎn)生。

Figure 1.Effects of catalase，DPI and apocynin on the generation of ROS in VSMCs induced by insulin.Serum starved VSMCs were pre-incubated with catalase(1.5× 106U/L)，DPI(5 μmol/L)or apocynin(20 μmol/L)for 30 min，and then stimulated with insulin(100 nmol/L)for 5 min.Mean ± SEM.n=6.*P ＜0.05 vs control;##P ＜0.01 vs insulin alone.圖1 Catalase、DPI和apocynin對(duì)胰島素誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞ROS水平的影響

2 胰島素產(chǎn)生的ROS介導(dǎo)了Akt/p70S6K1和ERK信號(hào)通路的激活

Western blotting結(jié)果顯示胰島素明顯刺激血管平滑肌細(xì)胞p-Akt(P＜0.01 vs對(duì)照組)、p-p70S6K1(P＜0.05 vs對(duì)照組)和p-ERK1/2(P＜0.01 vs對(duì)照組)蛋白的表達(dá)。Catalase和DPI可明顯抑制胰島素促進(jìn)的p-Akt(P＜0.01 vs胰島素組)、p-p70S6K1(P＜0.05 vs胰島素組)和p-ERK1/2(P＜0.01 vs胰島素組)蛋白的表達(dá)。這提示胰島素產(chǎn)生的ROS介導(dǎo)了Akt/p70S6K1和ERK信號(hào)通路的激活，見圖2。

3 ROS參與了胰島素促進(jìn)的VEGF表達(dá)

胰島素增加VEGF mRNA表達(dá)(圖3A)和蛋白表達(dá)(圖3B)，而且增加VEGF的轉(zhuǎn)錄活性(圖3C)(P＜0.01 vs對(duì)照組)。Catalase和DPI明顯降低胰島素促進(jìn)的VEGF mRNA表達(dá)(P＜0.01 vs胰島素組，圖3A)和蛋白表達(dá)(P＜0.01胰島素+catalase組vs胰島素組;P＜0.05胰島素+DPI組 vs胰島素組，圖3B)以及VEGF的轉(zhuǎn)錄激活(P＜0.01 vs胰島素組，圖 3C)。

4 降低ROS產(chǎn)生抑制胰島素促進(jìn)的血管平滑肌細(xì)胞遷移和增殖

Ctalase和DPI明顯抑制胰島素促進(jìn)的血管平滑肌細(xì)胞遷移(P＜0.01 vs胰島素組，圖4)和增殖(P＜0.01 vs胰島素組，圖5)。

Figure 2.Effects of catalase and DPI on the expression of p-Akt，p-p70S6K1 and p-ERK1/2 in VSMCs induced by insulin.Serum starved VSMCs were pre-incubated with catalase(1.5 ×106U/L)or DPI(5 μmol/L)for 30 min，and then stimulated with insulin(100 nmol/L)for 30 min.Relative protein expression levels were expressed as the ratios of p-Akt/Akt，p-p70S6K1/p70S6K1 and p-ERK/ERK，and then normalized to the control.Mean ± SEM.n=3.*P ＜ 0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs insulin alone.圖2 Catalase和DPI對(duì)胰島素促進(jìn)的p-Akt、p-p70S6K1和p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響

討 論

2型糖尿病患者常伴有高胰島素血癥，高濃度胰島素促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，參與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生和發(fā)展［8］。ROS作為許多刺激因子的第二信使，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和遷移，但ROS在胰島素引起的血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移中的作用和分子機(jī)制還不十分清楚。因此闡明胰島素促血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的分子機(jī)制，將為尋找有效的抗動(dòng)脈硬化和血管再狹窄的干預(yù)靶點(diǎn)提供新的思路。

Figure 3.Effects of catalase and DPI on the mRNA and protein expression of VEGF，and transcriptional activation of VEGF induced by insulin.A:the relative VEGF mRNA level was determined by real-time PCR;B:the VEGF content in the supernatants was determined by ELISA assay;C:the relative luciferase activity was determined by the ratio of luciferase to β-galactosidase activity and normalized to the control.Mean ± SEM.n=3.＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs insulin alone.圖3 Catalase和DPI對(duì)胰島素促進(jìn)的VEGF mRNA和蛋白表達(dá)以及轉(zhuǎn)錄活性的影響

Figure 4.Effects of catalase and DPI on insulin-induced VSMC migration.Mean±SEM.n=3.＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs insulin alone.圖4 Catalase和DPI對(duì)胰島素促進(jìn)的血管平滑肌細(xì)胞遷移的影響

NADPH氧化酶是血管細(xì)胞最主要的ROS來源。NADPH氧化酶主要由跨膜結(jié)構(gòu)(Nox亞基和p22phox)和胞漿成分(p47phox、p67phox、p40phox及 Rac1)組成［9］。研究表明，許多生長(zhǎng)因子如血管緊張素II、血小板源生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子等可引起NADPH氧化酶的激活，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞 ROS的生成［10］。本文研究證實(shí)用過氧化氫酶或NADPH氧化酶抑制劑DPI抑制胰島素刺激的血管平滑肌細(xì)胞ROS產(chǎn)生及細(xì)胞的遷移和增殖，提示胰島素通過NADPH氧化酶途徑促進(jìn)ROS產(chǎn)生，ROS介導(dǎo)了血管平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖。這與Mahadev等［11］的研究結(jié)果一致，他們證實(shí)在脂肪細(xì)胞上NADPH氧化酶亞基Nox4介導(dǎo)了胰島素引起的ROS產(chǎn)生。我們以往研究也證實(shí)Nox4參與了IGF-I刺激的血管平滑肌細(xì)胞ROS生成和細(xì)胞遷移［6］。

Figure 5.Effects of catalase and DPI on insulin-induced VSMC proliferation.Cell proliferation was detected by CCK-8 assay.Mean ± SEM.n=3.＊＊ P ＜ 0.01 vs control;##P ＜0.01 vs insulin alone.圖5 Catalase和DPI對(duì)胰島素促進(jìn)的血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響

胰島素與靶細(xì)胞表面的胰島素受體結(jié)合，激活酪氨酸激酶導(dǎo)致一系列胰島素受體底物磷酸化，進(jìn)而激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/Akt/p70S6K1兩條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用過氧化氫酶或DPI阻止 ROS產(chǎn)生，可抑制胰島素引起的 Akt/p70S6K1和ERK信號(hào)通路的激活，提示ROS介導(dǎo)了胰島素刺激的Akt/p70S6K1和ERK通路。研究表明，胞漿內(nèi)ROS增高可激活蛋白酪氨酸激酶并抑制蛋白酪氨酸磷酸酯酶(如 PTP1B、PTEN等)活性［11，13］，進(jìn)而經(jīng) PI3K/Akt途徑激活下游信號(hào)分子。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以上結(jié)論一致。

VEGF是重要的促血管生成因子，其可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖［14］。研究表明，PI3K抑制劑Wortmannin和ERK信號(hào)通路的抑制劑U0126能明顯抑制VEGF促進(jìn)的血管平滑肌細(xì)胞遷移和增殖［15-16］，提示 PI3K和 ERK信號(hào)通路在 VEGF介導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞遷移和增殖中起重要作用。本研究證實(shí)，抑制 ROS產(chǎn)生明顯降低胰島素促進(jìn)的VEGF轉(zhuǎn)錄激活以及mRNA和蛋白表達(dá)。以往研究表明，胰島素通過PI3K和MAPK信號(hào)通路調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞VEGF的表達(dá)［17］，因此我們推測(cè)胰島素促進(jìn)的 VEGF表達(dá)是通過ROS介導(dǎo)的 PI3K和MAPK信號(hào)通路激活完成的。最近的研究證實(shí)，在視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生參與了胰島素刺激的VEGF表達(dá)［18］，這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

總之，本研究表明，胰島素通過NADPH氧化酶途徑促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞ROS產(chǎn)生;ROS介導(dǎo)了胰島素促進(jìn)的Akt/p70S6K1和ERK信號(hào)通路的激活、VEGF表達(dá)及血管平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖。這項(xiàng)研究為闡明NADPH氧化酶來源的ROS調(diào)控胰島素促血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的分子機(jī)制提供了理論依據(jù)。

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