梅愛紅， 劉俊許， 陳思鋒， 孟 丹△

高胰島素血癥是2型糖尿病胰島素抵抗的特征 之一。研究表明，高于生理濃度的胰島素(insulin)可促進血管平滑肌細胞的增殖和遷移，在糖尿病病人動脈粥樣硬化和血管成形術后再狹窄的發(fā)生和發(fā)展過程中起關鍵作用［1］。

活性氧(reactive oxygen species，ROS)是反應活性極強的代謝分子，主要包括超氧自由基(O－·2)、過氧化氫(H2O2)和羥自由基(·OH)。雖然過多的ROS會引起細胞的衰老和凋亡［2-3］，但是低水平的ROS可作為許多刺激因子的第二信使，參與調(diào)節(jié)細胞的多種功能［4］。我們以往研究發(fā)現(xiàn)，ROS參與了胰島素樣生長因子I(insulin-like growth factor I，IGFI)引起的血管平滑肌細胞的增殖和遷移［5-6］。研究表明，胰島素促進血管平滑肌細胞 ROS的產(chǎn)生［7］，但是ROS在胰島素引起的血管平滑肌細胞增殖和遷移中的作用和分子機制還不十分清楚。本文中我們研究了ROS在胰島素促進的血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達及血管平滑肌細胞遷移和增殖中的作用，為臨床尋找有效的抗動脈粥樣硬化干預靶點提供理論基礎。

材料和方法

1 材料

8周齡健康雄性SD大鼠(Sprague-Dawley rats，體重約150 g)由中國科學院上海實驗動物中心提供。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰酶購于Invitrogen。2’，7’-二氯熒光素二乙酸酯(2’，7’-dichlorofluorescein diacetate，DCF-DA)購于 Molecular Probes。胰島素(insulin)、過氧化氫酶(catalase)、NADPH氧化酶抑制劑二亞苯基碘鎓(diphenylene iodonium，DPI)和夾竹桃麻素(apocynin)購于Sigma?？勾笫髉-ERK 1/2和 ERK2抗體購于 Santa Cruz，抗大鼠 p-Akt、Akt、p70 S6 激酶 1(p70 S6 kinase 1，p70S6K1)和p-p70S6K1購于Cellular Signaling。大鼠VEGF酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。SYBR Green購于Bio-Rad。CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所。

2 大鼠血管平滑肌細胞的原代培養(yǎng)

無菌操作取出SD大鼠胸主動脈，分離中膜平滑肌組織，用DMEM培養(yǎng)液洗滌3次，剝?nèi)ソY締組織與外膜，縱軸剖開，剝除內(nèi)膜，剪切成1 mm×1 mm×1 mm方塊，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中。加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，每周更換培養(yǎng)液1次，20 d后可見平滑肌細胞自移植塊邊緣長出并形成致密單層時，即開始傳代培養(yǎng)，之后的傳代培養(yǎng)用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液。平滑肌細胞通過形態(tài)學和α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)免疫組化方法鑒定。實驗選用第3～6代細胞。

實驗共分4組，分別是:對照組、胰島素組、胰島素+過氧化氫酶catalase組、胰島素+NADPH氧化酶抑制劑DPI組。

3 細胞內(nèi)ROS水平檢測

細胞內(nèi)ROS水平采用DCF-DA熒光探針法檢測。將細胞種于6孔板中，無血清處理12 h后，用catalase(1.5 ×106U/L)、DPI(5 μmol/L)或 apocynin(20 μmol/L)預處理細胞30 min，然后加入胰島素(100 nmol/L)處理細胞5 min，再加入 DCF-DA(5 μmol/L)避光37℃孵育15 min。細胞用PBS洗3次后，消化細胞成懸液，用流式細胞儀(Beckman Coulter)檢測細胞熒光強度，激發(fā)波長480 nm，發(fā)射波長540 nm。

4 蛋白免疫印跡

血管平滑肌細胞無血清處理后，預處理catalase(1.5 ×106U/L)和 DPI(5 μmol/L)30 min，加入胰島素(100 nmol/L)孵育30 min，然后裂解細胞，離心后取上清。用蛋白測定試劑盒(Bio-Rad)檢測蛋白濃度。蛋白上樣量50 μg，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜、5%脫脂牛奶封閉1 h后分別加 p-Akt、Akt、p-p70S6K1、p70S6K1、p-ERK 1/2和ERK2抗體(1∶1 000)，4℃孵育過夜;TBST洗3次，加上HRP標記的Ⅱ抗(1∶3 000)，室溫孵育1 h 30 min，TBST洗4次后進行ECL顯色發(fā)光。X光膠片用ImageJ圖像分析軟件進行蛋白定量分析。

5 實時定量PCR

收集細胞，采用Trizol法提取細胞總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas)說明書采用隨機引物進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用實時定量PCR試劑盒(Bio-Rad)，以SYBR Green為熒光探針，在real-time analyzer(Bio-Rad)儀器上進行實時定量PCR反應并分析結果，以GAPDH作為內(nèi)參照。引物序列如下:VEGF164上游引物 5’-ATCTTCAAGCCGTCCTGTGTGC-3’，下游引物 5’-CAAGGCTCACAGTGAACGCT-3’;GAPDH 上游引物5’-CCATCTTCCAGGAGCGAGATC-3’，下游引物 5’-GCCTTCTCCATGGTGGTGAA-3’。

6 報告基因熒光素酶檢測

按照Invitrogen公司說明書，用脂質(zhì)體(Lipofectamine 2000)轉(zhuǎn)染的方法，將含有VEGF啟動子片段(2.4 kb)的報告基因和β-半乳糖質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到血管平滑肌細胞，以轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒pGL2為空白對照。轉(zhuǎn)染24 h后，細胞無血清處理12 h，用catalase(1.5×106U/L)和 DPI(5 μmol/L)預處理細胞 30 min，然后加入胰島素(100 nmol/L)孵育20 h，制備細胞裂解物。按照螢光素酶報告基因分析系統(tǒng)(Luciferase Reporter Assay System;Promega)的說明書，在螢光素酶報告分析儀上檢測裂解物的螢光值。β-半乳糖酶活性的檢測是將裂解物與β-半乳糖酶檢測底物在37℃孵育1 h，然后置于酶標儀上，在420 nm波長下測吸光度值。螢光素酶報告基因的螢光值與內(nèi)參照β-半乳糖酶活性的比值即代表所檢測的VEGF啟動子片段的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。

7 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測培養(yǎng)上清中VEGF水平

細胞預處理catalase或DPI，加入胰島素孵育24 h后收集培養(yǎng)上清，上清中 VEGF的含量用大鼠VEGF ELISA試劑盒檢測，按照說明書步驟進行。通過VEGF的標準曲線計算上清中VEGF的含量，并用細胞蛋白含量作校正，以ng/(g protein)表示。

8 細胞遷移實驗

將細胞種于培養(yǎng)皿中，當細胞密度達到90%以上時，用無菌槍頭在培養(yǎng)皿底部作直線劃痕，PBS洗后將劃痕處拍照作為初始對照，然后加入catalase或DPI，并與胰島素孵育。24 h后顯微鏡下隨機選取10個視野進行拍照，與初始劃痕比較，測量劃痕兩邊細胞遷移的距離，取均值。

9 細胞增殖實驗

細胞預處理catalase或DPI，加入胰島素孵育24 h后將加有藥物的培養(yǎng)液吸出，加入含CCK-8的培養(yǎng)液，CCK-8與培養(yǎng)液的體積比例為1∶10，放置37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，在酶標儀上測定450 nm吸光度。

10 統(tǒng)計學處理

采用Prism 5.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，兩組間比較用獨立樣本t檢驗，多組間比較用單因素方差分析(One-way ANOVA)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 胰島素通過NADPH氧化酶途徑促進ROS產(chǎn)生

如圖1所示，胰島素處理血管平滑肌細胞5 min后，ROS水平與對照組相比明顯升高(P＜0.05)，catalase、DPI或 apocynin處理后，與胰島素組相比ROS水平明顯下降(P＜0.01)，提示胰島素通過NADPH氧化酶途徑促進ROS產(chǎn)生。

Figure 1.Effects of catalase，DPI and apocynin on the generation of ROS in VSMCs induced by insulin.Serum starved VSMCs were pre-incubated with catalase(1.5× 106U/L)，DPI(5 μmol/L)or apocynin(20 μmol/L)for 30 min，and then stimulated with insulin(100 nmol/L)for 5 min.Mean ± SEM.n=6.*P ＜0.05 vs control;##P ＜0.01 vs insulin alone.圖1 Catalase、DPI和apocynin對胰島素誘導的血管平滑肌細胞ROS水平的影響

2 胰島素產(chǎn)生的ROS介導了Akt/p70S6K1和ERK信號通路的激活

Western blotting結果顯示胰島素明顯刺激血管平滑肌細胞p-Akt(P＜0.01 vs對照組)、p-p70S6K1(P＜0.05 vs對照組)和p-ERK1/2(P＜0.01 vs對照組)蛋白的表達。Catalase和DPI可明顯抑制胰島素促進的p-Akt(P＜0.01 vs胰島素組)、p-p70S6K1(P＜0.05 vs胰島素組)和p-ERK1/2(P＜0.01 vs胰島素組)蛋白的表達。這提示胰島素產(chǎn)生的ROS介導了Akt/p70S6K1和ERK信號通路的激活，見圖2。

3 ROS參與了胰島素促進的VEGF表達

胰島素增加VEGF mRNA表達(圖3A)和蛋白表達(圖3B)，而且增加VEGF的轉(zhuǎn)錄活性(圖3C)(P＜0.01 vs對照組)。Catalase和DPI明顯降低胰島素促進的VEGF mRNA表達(P＜0.01 vs胰島素組，圖3A)和蛋白表達(P＜0.01胰島素+catalase組vs胰島素組;P＜0.05胰島素+DPI組 vs胰島素組，圖3B)以及VEGF的轉(zhuǎn)錄激活(P＜0.01 vs胰島素組，圖 3C)。

4 降低ROS產(chǎn)生抑制胰島素促進的血管平滑肌細胞遷移和增殖

Ctalase和DPI明顯抑制胰島素促進的血管平滑肌細胞遷移(P＜0.01 vs胰島素組，圖4)和增殖(P＜0.01 vs胰島素組，圖5)。

Figure 2.Effects of catalase and DPI on the expression of p-Akt，p-p70S6K1 and p-ERK1/2 in VSMCs induced by insulin.Serum starved VSMCs were pre-incubated with catalase(1.5 ×106U/L)or DPI(5 μmol/L)for 30 min，and then stimulated with insulin(100 nmol/L)for 30 min.Relative protein expression levels were expressed as the ratios of p-Akt/Akt，p-p70S6K1/p70S6K1 and p-ERK/ERK，and then normalized to the control.Mean ± SEM.n=3.*P ＜ 0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs insulin alone.圖2 Catalase和DPI對胰島素促進的p-Akt、p-p70S6K1和p-ERK1/2蛋白表達的影響

討 論

2型糖尿病患者常伴有高胰島素血癥，高濃度胰島素促進血管平滑肌細胞的增殖和遷移，參與動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生和發(fā)展［8］。ROS作為許多刺激因子的第二信使，參與調(diào)節(jié)細胞的增殖和遷移，但ROS在胰島素引起的血管平滑肌細胞增殖和遷移中的作用和分子機制還不十分清楚。因此闡明胰島素促血管平滑肌細胞增殖和遷移的分子機制，將為尋找有效的抗動脈硬化和血管再狹窄的干預靶點提供新的思路。

Figure 3.Effects of catalase and DPI on the mRNA and protein expression of VEGF，and transcriptional activation of VEGF induced by insulin.A:the relative VEGF mRNA level was determined by real-time PCR;B:the VEGF content in the supernatants was determined by ELISA assay;C:the relative luciferase activity was determined by the ratio of luciferase to β-galactosidase activity and normalized to the control.Mean ± SEM.n=3.＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs insulin alone.圖3 Catalase和DPI對胰島素促進的VEGF mRNA和蛋白表達以及轉(zhuǎn)錄活性的影響

Figure 4.Effects of catalase and DPI on insulin-induced VSMC migration.Mean±SEM.n=3.＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs insulin alone.圖4 Catalase和DPI對胰島素促進的血管平滑肌細胞遷移的影響

NADPH氧化酶是血管細胞最主要的ROS來源。NADPH氧化酶主要由跨膜結構(Nox亞基和p22phox)和胞漿成分(p47phox、p67phox、p40phox及 Rac1)組成［9］。研究表明，許多生長因子如血管緊張素II、血小板源生長因子、表皮生長因子等可引起NADPH氧化酶的激活，促進血管平滑肌細胞 ROS的生成［10］。本文研究證實用過氧化氫酶或NADPH氧化酶抑制劑DPI抑制胰島素刺激的血管平滑肌細胞ROS產(chǎn)生及細胞的遷移和增殖，提示胰島素通過NADPH氧化酶途徑促進ROS產(chǎn)生，ROS介導了血管平滑肌細胞的遷移和增殖。這與Mahadev等［11］的研究結果一致，他們證實在脂肪細胞上NADPH氧化酶亞基Nox4介導了胰島素引起的ROS產(chǎn)生。我們以往研究也證實Nox4參與了IGF-I刺激的血管平滑肌細胞ROS生成和細胞遷移［6］。

Figure 5.Effects of catalase and DPI on insulin-induced VSMC proliferation.Cell proliferation was detected by CCK-8 assay.Mean ± SEM.n=3.＊＊ P ＜ 0.01 vs control;##P ＜0.01 vs insulin alone.圖5 Catalase和DPI對胰島素促進的血管平滑肌細胞增殖的影響

胰島素與靶細胞表面的胰島素受體結合，激活酪氨酸激酶導致一系列胰島素受體底物磷酸化，進而激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/Akt/p70S6K1兩條信號轉(zhuǎn)導途徑［12］。本實驗結果表明，用過氧化氫酶或DPI阻止 ROS產(chǎn)生，可抑制胰島素引起的 Akt/p70S6K1和ERK信號通路的激活，提示ROS介導了胰島素刺激的Akt/p70S6K1和ERK通路。研究表明，胞漿內(nèi)ROS增高可激活蛋白酪氨酸激酶并抑制蛋白酪氨酸磷酸酯酶(如 PTP1B、PTEN等)活性［11，13］，進而經(jīng) PI3K/Akt途徑激活下游信號分子。本實驗結果與以上結論一致。

VEGF是重要的促血管生成因子，其可促進血管平滑肌細胞的遷移和增殖［14］。研究表明，PI3K抑制劑Wortmannin和ERK信號通路的抑制劑U0126能明顯抑制VEGF促進的血管平滑肌細胞遷移和增殖［15-16］，提示 PI3K和 ERK信號通路在 VEGF介導的血管平滑肌細胞遷移和增殖中起重要作用。本研究證實，抑制 ROS產(chǎn)生明顯降低胰島素促進的VEGF轉(zhuǎn)錄激活以及mRNA和蛋白表達。以往研究表明，胰島素通過PI3K和MAPK信號通路調(diào)控血管平滑肌細胞VEGF的表達［17］，因此我們推測胰島素促進的 VEGF表達是通過ROS介導的 PI3K和MAPK信號通路激活完成的。最近的研究證實，在視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞中ROS的產(chǎn)生參與了胰島素刺激的VEGF表達［18］，這與我們的實驗結果一致。

總之，本研究表明，胰島素通過NADPH氧化酶途徑促進血管平滑肌細胞ROS產(chǎn)生;ROS介導了胰島素促進的Akt/p70S6K1和ERK信號通路的激活、VEGF表達及血管平滑肌細胞的遷移和增殖。這項研究為闡明NADPH氧化酶來源的ROS調(diào)控胰島素促血管平滑肌細胞增殖和遷移的分子機制提供了理論依據(jù)。

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