張俊霞， 張騰騰， 張利軍， 王蓓蓓， 魏俊燕， 王海偉， 沈炳玲， 張麗莙

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)引發(fā)的心腦血管疾病是目前人類死亡的首要原因，嚴重威脅人類健康。自Ross提出“AS是一種慢性炎癥性疾病”［1］以來，感染性因素，尤其是肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae，C.pn)感染與AS的關系倍受關注［2-3］。血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)由動脈壁中膜向內膜遷移是AS發(fā)病過程中的關鍵環(huán)節(jié)之一。研究表明，C.pn感染可以通過多種途徑誘導細胞遷移［4-5］。Rac1是小G蛋白Rho家族成員，其通過GTP結合的有活性形式和GDP結合的無活性形式循環(huán)調節(jié)多種信號轉導途徑，在肌動蛋白細胞骨架重組、細胞遷移中發(fā)揮重要作用［6-7］。磷脂酰肌醇 3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)是具有催化活性的胞內信號蛋白，在細胞遷移等多種信號轉導中發(fā)揮重要作用［8-9］，且與Rac1關系密切［10］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)C.pn感染通過激活PI3K及其信號途徑促進內皮細胞、VSMCs遷移［11-12］。C.pn感染是否能誘導VSMCs內Rac1活化并通過其調控VSMCs遷移，以及在此過程中PI3K是否對Rac1的活化發(fā)揮調節(jié)作用，目前尚不清楚。本研究以Rac1為著眼點，采用GST-pull down實驗觀察C.pn感染VSMCs后Rac1活性的變化，并使用PI3K特異性抑制劑進一步探討PI3K對C.pn感染誘導VSMCs內Rac1活化的調節(jié)作用，為闡明C.pn感染誘導VSMCs遷移的相關分子機制及有效防治AS提供新思路。

材料和方法

1 材料

SD大鼠主動脈原代VSMCs為本課題組分離、培養(yǎng)并鑒定［13］;C.pn AR-39 株 (美國標準菌庫，ATCC53592);DMEM細胞培養(yǎng)基(Gibco);胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS;Gibco);DEAE(Sigma);Glutathione Sepharose 4B(GE Heathcare);GST-PBD重組質粒為本實驗室保存;感受態(tài)細菌E.coli BL21(北京全式金生物技術有限公司);異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)(Prommega);小鼠抗大鼠 Rac1抗體(BD);小鼠抗大鼠βactin抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司);辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG(Jackson);Rac1抑制劑NSC23766(Merck);PI3K抑制劑LY294002(Prommega);BCA蛋白定量試劑盒(江蘇碧云天生物技術研究所);ECL發(fā)光液(江蘇碧云天生物技術研究所);蛋白酶抑制劑(Thermo);羥基脲(Sigma);Transwell小室(Corning)。

2 方法

2.1 VSMCs的培養(yǎng)和實驗分組 VSMCs用含10%FBS的DMEM在37℃、5%CO2恒溫孵箱中培養(yǎng)，細胞生長至90%單層融合后，0.25%胰蛋白酶消化液消化傳代，選擇生長良好的3～8代細胞用于實驗。實驗分組如下:正常對照組、C.pn感染組、NSC23766組、NSC23766 +C.pn感染組、LY294002組和LY294002 + C.pn感染組。NSC23766組和NSC23766 + C.pn感染組、LY294002組 和LY294002+C.pn感染組的 VSMCs分別用 50 μmol/L NSC23766、25 μmol/L LY294002 37 ℃孵育1 h進行預處理。同時，遷移實驗中使用羥基脲0.8 mmol/L預處理細胞12 h，消除細胞增殖對遷移實驗結果的影響。

2.2 GST-PBD融合蛋白的表達及純化 用成功構建的GST-PBD質粒轉化感受態(tài)細菌E.coli BL21，按1∶1 000的比例接種于5 mL LB培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期(600 nm吸光度值為0.4～0.6)。挑取對數(shù)期細菌，按照1∶5 000的比例接種入100 mL LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。次日加入IPTG(0.1 mmol/L)，28℃、130 r/min誘導蛋白表達3 h。4℃2 800 r/min離心30 min收集菌體，細菌裂解液(1%Triton X-100，1×PBS)重懸菌體沉淀，超聲裂解。4℃、13 000 r/min離心10 min，取上清，每1 mL上清液加入50 μL Glutathione Sepharose 4B，4℃ 孵育過夜，1×PBS洗滌4次，置4℃?zhèn)溆谩?/p>

2.3 GST-pull down實驗檢測VSMCs Rac1的活性

按照王蓓蓓等［13］的方法，在HEp-2細胞中增殖培養(yǎng)C.pn并感染VSMCs。感染24 h后，用含蛋白酶抑制劑的裂解液于冰上裂解細胞30 min，細胞刮刀刮取細胞，4℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清，用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。取1.0 mg相應體積的蛋白樣品與孵育后的Glutathione Sepharose 4B混合，4℃過夜。次日4℃、1 000 r/min離心5 min，同樣條件洗滌4次，微量加樣器吸干EP管內剩余液體，加入40 μL 1×上樣緩沖液，煮沸10 min。隨后，行12%SDS-PAGE并轉印于PVDF膜。特異性抗體孵育檢測目標蛋白，ECL發(fā)光液顯影、定影后拍照，并用ImageJ軟件進行條帶灰度分析。

2.4 Wound-healing實驗 將VSMCs接種至6孔板，90%融合后，同步化處理12 h，加入0.8 mmol/L羥基脲作用12 h，用無菌移液管尖在培養(yǎng)板單層細胞的相同位置劃直線，造成“傷口”，PBS洗去脫落細胞。NSC23766預處理VSMCs 1 h后，接種感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為0.5 的 C.pn 并孵育24 h，顯微鏡下觀察VSMCs從劃痕處向中央爬行的面積，其面積大小表示VSMCs遷移能力強弱，每孔隨機取6個視野進行觀察并拍攝，應用圖像分析軟件ImageJ測量細胞遷移面積，計算平均值，行3次獨立實驗。

2.5 Transwell實驗 將 VSMCs接種至6孔板，90%融合后，同步化處理12 h，加入0.8 mmol/L羥基脲作用12 h，NSC23766預處理VSMCs 1 h后，將MOI為0.5的C.pn懸液接種于VSMCs，感染16 h后制備細胞濃度為1.5×108/L的VSMCs懸液，取100 μL細胞懸液加入 Transwell上室中，下室加入含50%FBS的DMEM，8 h后室溫下甲醇固定，結晶紫染色。倒置相差顯微鏡下每個小室隨機選取6個視野進行拍攝，記錄每個視野的穿膜細胞數(shù)，取平均值，行3次獨立實驗。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，3組以上樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，均數(shù)間兩兩比較采用q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 GST-PBD融合蛋白的誘導與純化

使用GST-PBD重組質粒轉化感受態(tài)細菌E.coli BL21，LB培養(yǎng)基中擴增，并通過IPTG誘導GST-PBD融合蛋白的表達，隨后用Glutathione Sepharose 4B富集純化。為了保證GST-PBD與GTP-Rac1的特異性結合，純化表達GST-PBD蛋白的同時表達GST空載體。為鑒定并檢測純化蛋白的質量及濃度，將純化得到的GST和GST-PBD蛋白經SDS-PAGE后考馬斯亮藍染色，見圖1，純化得到的融合蛋白分子量正確，且濃度達到實驗要求。

Figure 1.The purification of glutathione S-transferase(GST)-p21-binding domain of p21-activated kinase 1(PBD)(GST-PBD)fusion protein.M:protein marker;1:GST vector;2:GST-PBD fusion protein圖1 純化的GST-PBD融合蛋白

2 C.pn感染VSMCs前后Rac1活性的變化

VSMCs經C.pn感染24 h后提取總蛋白，并與經過鑒定達到實驗要求的純化融合蛋白孵育，GST-pull down實驗檢測C.pn感染前后GTP-Rac1變化;同時以GST空載體作為陰性對照。結果顯示，C.pn感染組GTP-Rac1表達水平顯著上調(P＜0.05)，且GST-PBD融合蛋白與GTP-Rac1特異性結合，此結果可真實反映細胞內Rac1的活化水平，見圖2。

Figure 2.The C.pn infection-induced Rac1 activation detected by GST-pull down assay.1:control group;2:C.pn infection group;3:GST incubation with cell lyses.Mean ± SD.n=4.*P ＜0.05 vs control group.圖2 C.pn感染誘導VSMCs Rac1的活化

3 C.pn感染誘導PI3K依賴的Rac1活性上調

我們前期研究結果顯示PI3K/Akt在C.pn感染誘導的VSMCs遷移中發(fā)揮重要作用［11］。為證實PI3K在C.pn感染誘導的VSMCs Rac1活化中的作用，我們使用LY294002預處理VSMCs，進而采用GST-pull down實驗檢測GTP-Rac1的表達水平。結果顯示，LY294002+C.pn感染組GTP-Rac1表達明顯低于 C.pn感染組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。各組之間總Rac1的表達量無明顯差別，見圖3。

4 Rac1活化在C.pn感染誘導的VSMCs遷移中的作用

C.pn感染 VSMCs 24 h后，wound-healing實驗中，C.pn感染組VSMCs向劃痕中央遷移的面積明顯大于正常對照組(P＜0.05)，NSC23766預處理后VSMCs的Rac1活性被抑制，NSC23766+C.pn感染組VSMCs向劃痕中央遷移的面積顯著小于C.pn感染組(P ＜0.05)，見圖 4;Transwell實驗中，C.pn感染組穿膜的VSMCs數(shù)明顯高于正常對照組(P＜0.05)，而 NSC23766+C.pn 感染組 VSMCs的穿膜數(shù)明顯低于 C.pn感染組(P ＜0.05)，見圖5。

Figure 3.The role of PI3K in Rac1 activation in C.pn-infected VSMCs detected by GST-pull down assay.1:control group;2:C.pn infection group;3:LY294002 group;4:LY294002+C.pn infection group.Mean ±SD.n=4.*P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs C.pn infection group.圖3 PI3K在C.pn感染誘導的VSMCs Rac1活化中的作用

Figure 4.The role of Rac1 activation in C.pn infection-induced migration of VSMCs detected by wound-healing assay.1:control group;2:C.pn infection group;3:NSC23766 group;4:NSC23766+C.pn infection group.Mean ± SD.n=6.*P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs C.pn infection group.圖4 Wound-healing實驗檢測Rac1在C.pn感染誘導VSMCs遷移中的作用

Figure 5.The role of Rac1 activation in C.pn infection-induced migration of VSMCs detected by Transwell assay.1:control group;2:C.pn infection group;3:NSC23766 group;4:NSC23766+C.pn infection group.Mean ± SD.n=6.*P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs C.pn infection group.圖5 Transwell實驗檢測Rac1在C.pn感染誘導VSMCs遷移中的作用

討 論

近年來，C.pn感染作為AS新的危險因素日益受到關注。C.pn是一種嚴格細胞內寄生菌，經呼吸道侵入機體后感染其寄居部位(肺泡)的單核細胞［14］并以單核-巨噬細胞為載體經血行遷移至動脈壁，可感染內皮細胞、VSMCs及巨噬細胞等AS相關細胞［15］，參與AS的發(fā)生發(fā)展。本課題組前期已成功建立C.pn感染內皮細胞、VSMCs的模型，為進一步研究其致病機制奠定了基礎。VSMCs由血管壁中膜遷向內膜在AS形成及進展中發(fā)揮重要作用。研究表明，C.pn感染可通過炎癥介質及細胞因子的釋放影響細胞遷移［4-5］。但是，C.pn感染 VSMCs后是否能通過增強VSMCs的內在動力系統(tǒng)來促進其遷移，目前鮮有報道。

細胞遷移與免疫監(jiān)視、傷口愈合、AS、炎癥反應、腫瘤轉移等多種生理、病理過程相關，是一個緊密協(xié)調的過程。其中，“l(fā)eading edge”處的質膜突起或片狀偽足的延伸是細胞遷移的主要驅動力。研究表明，片狀偽足的形成是由Rac1介導的［6-7］。C.pn感染又與Rac1關系密切，C.pn感染的單核細胞GTPRac1表達增加［16］。那么，C.pn感染 VSMCs后能否引起Rac1的活性變化，目前尚不清楚。為此，我們使用成功構建的GST-PBD質粒轉化感受態(tài)細菌，擴增并誘導表達GST-PBD融合蛋白，特異性地與GTPRac1結合以檢測細胞內Rac1的活性。實驗結果顯示C.pn感染后VSMCs Rac1的活性明顯高于正常對照組。Gou?ffic等［17］研究顯示透明質酸可通過激活Rac1誘導VSMCs片狀偽足形成進而促使細胞遷移。為了明確Rac1的活化在C.pn感染誘導的VSMCs遷移中的作用，我們使用 Rac1特異性抑制劑NSC23766(50 μmol/L)預處理 VSMCs，采用 woundhealing實驗和Transwell實驗觀察VSMCs遷移能力的變化。實驗結果顯示，預處理組C.pn感染誘導的細胞遷移能力明顯低于單純C.pn感染組。Rac1抑制劑NSC23766通過與Rac1的鳥嘌呤核苷酸交換因子Trio和Tiom相互作用干擾Rac1的磷酸化，并不影響Rac1的表達水平。相關文獻［18］及我們的預實驗結果顯示NSC23766(50 μmol/L)預處理可有效抑制Rac1的活化。這提示C.pn感染可能通過激活Rac1促進VSMCs遷移。

Rac1作為細胞信號轉導中的分子開關，通過與GTP/GDP結合形式之間的轉換，接受外部刺激并作用于細胞骨架或其靶蛋白，發(fā)揮生物學效應［7］。PI3K作為具有催化活性的胞內信號蛋白，在多種類型細胞遷移過程中發(fā)揮調控作用［8-9］。文獻［16］報道，透明質酸誘導的Rac1活化依賴PI3K的活性。PI3K-Rac1信號通路在IL-8引起的內皮細胞遷移中也發(fā)揮重要作用［19］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt在C.pn感染誘導的 VSMCs遷移中發(fā)揮重要作用［11］，PI3K 抑制劑 LY294002(25 μmol/L)可有效抑制C.pn感染誘導的細胞遷移。為進一步探討C.pn感染的VSMCs中PI3K對Rac1活化的影響，我們使用LY294002預處理VSMCs，GST-pull down實驗檢測Rac1活性的變化。實驗結果顯示，與C.pn感染組相比，預處理組VSMCs GTP-Rac1表達明顯降低，這提示在C.pn感染誘導的VSMCs遷移中Rac1的活化是PI3K依賴性的。有文獻也報道，PI3K抑制條件下，胰島素誘導的Rac1上調及質膜突起的形成受到抑制［20］。PI3K對Rac1活性的影響可能通過其與Rac1的鳥嘌呤核苷酸交換因子相互作用來實現(xiàn)［21］。

研究表明，活化的Rac1可以與IQGAP1相互作用并激活Arp2/3復合物、APC促進肌動蛋白聚合及細胞遷移［22］。Tang 等［23］報道胸腺素 β4通過增強IQGAP1/Rac1信號通路誘導結腸癌細胞遷移及臨床轉移。我們研究也發(fā)現(xiàn)IQGAP1可調控C.pn感染誘導的VSMCs黏附和遷移［24］。然而，在 C.pn感染誘導的VSMCs遷移過程中，Rac1與IQGAP1之間的相互關系目前尚不明確，有待于進一步研究。

綜上所述，PI3K依賴的Rac1活化在C.pn感染誘導的VSMCs遷移中發(fā)揮重要作用，這一結果將為進一步闡明C.pn感染誘導VSMCs遷移的分子機制以及尋找抑制VSMCs遷移和有效治療AS的途徑提供新思路。

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