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        點帶石斑魚魚皮和鱗片膠原蛋白的提取及理化性質(zhì)的研究

        2013-11-06 06:45:06黃亞冬邢克智劉海學王金娥陳成勛王慶奎
        關(guān)鍵詞:石斑魚魚皮魚鱗

        黃亞冬,邢克智,劉海學,王金娥,陳成勛,王慶奎

        (天津農(nóng)學院a.水產(chǎn)科學系,b.天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室,c.農(nóng)業(yè)分析測試中心,天津 300384)

        膠原蛋白(collagen)是生物體內(nèi)廣泛存在的一種重要蛋白質(zhì),也是結(jié)締組織的主要蛋白成分.與來源于陸生哺乳動物的膠原蛋白相比,水產(chǎn)動物原料通常具有高蛋白、低脂肪的特點,能夠避免動物性傳染病的傳播,安全性好,非常適宜于制備膠原產(chǎn)品[1].近年來以水產(chǎn)動物為原料制備的膠原蛋白產(chǎn)品被世界公認為一種安全性較高的膠原蛋白來源,備受國內(nèi)外消費市場的青睞.

        點帶石斑魚(Epinephelus malabaricus),隸屬鱸形目(Perciformes)、科(Serranidae)、石斑魚屬(Epinephlus).其營養(yǎng)豐富,肉質(zhì)鮮美,蛋白含量高,富含必需氨基酸,為優(yōu)質(zhì)的食用經(jīng)濟魚類,是許多國家捕撈和養(yǎng)殖的對象.本課題組以點帶石斑魚為實驗材料,從魚皮和魚鱗中提取膠原蛋白,并通過紫外吸收、氨基酸分析、SDS-PAGE 電泳分析和傅里葉變換紅外光譜對膠原蛋白的純度和結(jié)構(gòu)特征進行研究,為點帶石斑魚膠原蛋白的制備和應用提供基礎(chǔ)資料.

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        1.1.1 原材料預處理

        點帶石斑魚凍品低溫解凍后,在冰水浴中手工剝離魚皮和魚鱗,去除魚皮下的脂肪、肌肉組織以及魚鱗中的雜物,自來水洗凈,瀝干.

        1.1.2 試劑與儀器

        SDS-PAGE 相對分子質(zhì)量標準蛋白,加拿大Fermentas 公司生產(chǎn);牛跟腱Ⅰ型膠原蛋白標準品(BATC),北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn);L-羥脯氨酸、氯胺T、二甲基氨基苯甲醛、丙烯酰胺、N,N′-甲叉雙丙烯酰胺、三羥基氨基甲烷(Tris)、過硫酸銨、四甲基二乙胺,均為北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司生產(chǎn);所用試劑均為國產(chǎn)分析純級.

        雙光束紫外可見分光光度計UV-1901,北京普析通用儀器有限公司生產(chǎn);冷凍干燥機FPL1-1200,上海愛朗儀器有限公司生產(chǎn);差示掃描量熱儀DSC6220,精工電子納米科技有限公司生產(chǎn);高速低溫離心機,賽默飛世爾科技(中國)有限公司生產(chǎn);氨基酸全自動分析儀HITACH L-8900,日本HITACH 公司生產(chǎn);傅里葉變換紅外光譜儀Spectrum 65,美國PerkinElmer 公司生產(chǎn);電泳凝膠成像分析儀SN-NJ060C,北京信諾萊伯儀器有限公司生產(chǎn).

        1.2 膠原蛋白的提取

        將魚皮剪碎,用體積分數(shù)為10%的正丁醇在4 ℃下攪拌脫脂24 h,蒸餾水洗凈后用0.1 mol/L NaOH 在4 ℃下攪拌6 h,去除雜質(zhì)蛋白.過濾,用蒸餾水洗至中性,冷凍干燥.

        將魚鱗浸泡于0.5 mol/L 的EDTA 溶液(pH7.4)中,4 ℃下攪拌脫鈣48 h,每12 h 更換1 次溶液,然后用去離子水清洗,瀝干,冷凍干燥.

        1.3 膠原蛋白的純化

        稱取1.2 中魚皮和魚鱗凍干品各2 g,分別加入0.5 mol/L 冰醋酸溶液攪拌24 h 后,10 000 r/min 離心30 min,沉淀用同樣的條件再處理1 次,合并2次上清液,加NaCl 至終濃度0.9 mol/L,鹽析過夜.10 000 r/min 離心30 min,棄上清液.沉淀用0.5 mol/L 冰醋酸溶液溶解,10 000 r/min 離心30 min.取上清液,重復鹽析和溶解,用0.1 mol/L 冰醋酸溶液透析48 h 脫鹽,再用蒸餾水透析24 h,冷凍干燥.所有處理及操作均在4 ℃下進行.

        1.4 膠原蛋白純度及理化性質(zhì)測定

        膠原蛋白純度的測定,參照Reddy 等[2]的方法;熱變性溫度測定,參照Kanokwan 等[3]的方法;膠原蛋白氨基酸分析,參照GB/T 18246-2000 的方法;傅里葉變換紅外光譜(FTIR),采用傅里葉變換紅外光譜儀測定其吸收光譜,參照Wang 等[4]的方法;電動勢及溶解度分析,參照Kanokwan 等[3]的方法.

        紫外可見光譜掃描:準確稱取純化的膠原蛋白樣品,溶解于0.5 mol/L 冰醋酸溶液中(4 ℃下進行),配成質(zhì)量分數(shù)為0.05%膠原蛋白溶液.樣品處理液采用雙光束紫外可見分光光度計進行紫外可見光譜掃描,波長間隔1 nm,波長為190~400 nm.

        SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE):參照Wang 等[4]的方法并稍作改動.即SDS-PAGE 采用6%(質(zhì)量分數(shù))分離膠與5%(質(zhì)量分數(shù))濃縮膠不連續(xù)電泳系統(tǒng),具體配方如表1 所示.將膠原蛋白樣品溶解于0.5 mol/L Tris-HCl(pH 6.8)至最終質(zhì)量分數(shù)為0.1%,將樣品溶液與樣品緩沖液等體積混合,100 ℃水浴5 min 后取出立即放入冰水浴中冷卻,然后4 ℃、10 000 r/min 離心10 min,取15 μL 上清液至垂直電泳槽,在50 mA 電流下電泳,最后進行染色脫色處理.

        表1 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳配方Tab.1 Formula of SDS polyacrylamide gel electrophoresis mL

        1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

        實驗數(shù)據(jù)用平均值± 標準誤差(Mean±SE)表示,在單因子方差分析的基礎(chǔ)上采用Duncan 多重比較法檢驗組間差異(P=0.05).所有數(shù)據(jù)均采用軟件SPSS17.0 進行分析.

        2 結(jié)果與討論

        2.1 膠原蛋白的提取率及其純度

        魚皮膠原蛋白(SKC)和魚鱗膠原蛋白(SCC)的提取率分別為76.21%和2.50%.吸光度值(A)和樣品中羥脯氨酸濃度(C)呈線性正相關(guān),回歸方程為:A=0.073 4C+0.002 8(R2=0.999 3).永井裕等[5]認為羥脯氨酸僅存在于膠原蛋白、彈性蛋白和伸展蛋白中,而不存在于一般蛋白質(zhì)中,其在膠原蛋白中的含量為膠原氨基酸總質(zhì)量的10%左右.

        經(jīng)測定,本研究提取的SKC 和SCC 的純度分別為91%和85%.

        2.2 紫外可見光譜掃描分析

        將提取的SKC 和SCC 用0.5 mol/L 冰醋酸溶液溶解,在190~400 nm 的近紫外光區(qū)進行全波長掃描,結(jié)果如圖1 所示.SKC 和SCC 在231 nm 處具有最大吸收峰,牛跟腱Ⅰ型膠原蛋白標準品在232 nm 處具有最大吸收峰,A 值分別為0.516、0.454 和0.532,符合膠原蛋白通常的紫外吸收特性,即SKC和SCC 存在Ⅰ型膠原蛋白的特征吸收峰.

        2.3 熱變性溫度(DSC)的測定

        SKC 和SCC 的DSC 曲線如圖2 所示.SKC 的熱變性溫度為40.16 ℃,SCC 的熱變性溫度為42.06 ℃,這表明SCC 的熱穩(wěn)定性稍高于SKC.點帶石斑魚生活的水溫在15~34 ℃,其膠原蛋白的熱變性溫度高于最大生長溫度,這和一些溫、熱帶魚種來源的膠原蛋白相似,如尼羅河鱸魚(生長溫度18~32 ℃,膠原蛋白熱變性溫度36.5 ℃)、金槍魚(生長溫度20~28 ℃,膠原蛋白熱變性溫度29.7 ℃)、香魚(生長溫度20~28 ℃,膠原蛋白熱變性溫度29.7 ℃)等[4,6-7].這表明膠原蛋白的熱穩(wěn)定性與來源物種的種類和棲息環(huán)境溫度有關(guān),此結(jié)論與Rigby 的報道一致[8].

        2.4 氨基酸組成

        表2 中給出了點帶石斑魚SKC 和SCC 的氨基酸組分的質(zhì)量分數(shù).SKC 和SCC 中含量最豐富的氨基酸為甘氨酸,丙氨酸、谷氨酸和脯氨酸的含量也很高,而甲硫氨酸、組氨酸含量較低,半胱氨酸和酪氨酸沒有發(fā)現(xiàn),符合膠原蛋白的氨基酸組成分布[9].魚皮和魚鱗亞氨基酸(脯氨酸)含量分別為4.84%和5.60%,點帶石斑魚較低的亞氨基酸含量與較低的變性溫度符合“蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性與亞氨基酸含量呈正相關(guān)”這一結(jié)論[10].

        表2 提取膠原蛋白的常規(guī)氨基酸組成Tab.2 Composition of amino acid in soluble collagens extracted from scales and skin of grouper %

        2.5 傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)

        圖3 和表3 顯示了點帶石斑魚SKC、SCC 的紅外吸收光譜及主要吸收峰.

        表3 點帶石斑魚SKC 和SCC 的光譜峰位及其歸屬Tab.3 FTIR spectra peak locations and assignments for acid soluble SKC and SCC of grouper

        AmideⅠ帶和蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)有關(guān),SKC和SCC 的Amide Ⅰ帶分別出現(xiàn)在1 656.95 和1 641.35 cm-1,說明這2 種膠原蛋白的二級結(jié)構(gòu)相似.Amide Ⅲ帶是由N—H 彎曲振動引起的特征吸收峰,SKC 和SCC 的Amide Ⅲ帶分別出現(xiàn)在1 239.58和1 240.00 cm-1,證明提取的膠原蛋白存在完整的三螺旋結(jié)構(gòu)[11].Amide A 峰與N—H 伸縮振動有關(guān)[12],根據(jù)Doyle 理論,游離的N—H 伸縮振動在3 400~3 440 cm-1,N—H 參與氫鍵形成時振動頻率顯著降低.SKC 的Amide A 在3 436.16 cm-1,SCC 的Amide A 在3 435.94 cm-1,說明2 種膠原蛋白中幾乎沒有或者有很少的N—H 鍵參與氫鍵形成.SKC 的AmideⅠ和AmideⅡ吸收峰振動頻率(分別為1 656.95 cm-1,1 551.33 cm-1)稍高于SCC的值(1 641.35 cm-1,1 554 cm-1),這些峰的振動頻率與膠原蛋白的分子有序度呈正相關(guān)[13],因此說明SKC 具有比SCC 更高的分子有序度.

        2.6 SKC 和SCC 的組成及相對分子質(zhì)量

        SKC 和SCC 樣品經(jīng)SDS-PAGE 電泳后,結(jié)果如圖4 所示.

        魚皮和魚鱗所提取出來的膠原蛋白結(jié)構(gòu)相似,屬于Ⅰ型膠原蛋白,除了α1和α2鏈,還有β 和γ鏈,如表4 所示.通常認為β 鏈為α 鏈的二聚體,而γ 鏈為α 鏈的三聚體.α1和α3組分在SDS-PAGE膠上無法辨別[21],因此條帶α1還可能含有α3成分.

        表4 魚皮、鱗片膠原蛋白的相對分子質(zhì)量(以0.8 mg/mL 為例)Tab.4 Chain molecular weight of collagens from skin and scales(0.8 mg/mL,for example)

        2.7 電動勢分析

        SKC 和SCC 在不同pH 條件下的電動勢如圖5所示.在pH 為2~7 范圍內(nèi),電動勢值均為正值,而在pH 為8 和9 時出現(xiàn)負值.由于凈電荷為零處被認為是蛋白質(zhì)的等電點,因此,由圖5 可得,SKC和SCC 的等電點分別為pH 7.12 和7.15,兩者等電點極為相似,這可能與其氨基酸組成的含量有關(guān).

        2.8 溶解性

        不同pH 條件下點帶石斑魚SKC、SCC 的溶解性結(jié)果如圖6(a)所示.在酸性pH(2~4)內(nèi),兩者都表現(xiàn)出高的溶解性(P≤0.05).pH 值高于4 時,兩者的溶解度均表現(xiàn)出不同的下降趨勢,在中性和弱堿性條件下溶解性降至最低.本文結(jié)論與Bae 等[22]對虎皮膠原蛋白的研究結(jié)果相似.

        不同濃度的NaCl 溶液對石斑魚SKC、SCC 的溶解性影響結(jié)果如圖6(b)所示.在10 和20 g/L NaCl 質(zhì)量濃度下兩者的溶解性與對照組(0 g/L NaCl 質(zhì)量濃度)差異不具有統(tǒng)計學意義(P >0.05).當NaCl 質(zhì)量濃度大于30 g/L 時,2 種蛋白的溶解度急劇下降,這與Ahmad 和Benjakul[23]的結(jié)論相同.NaCl 質(zhì)量濃度在40~60 g/L 時,SKC、SCC 的溶解度很低,這很可能是蛋白質(zhì)的鹽析現(xiàn)象.Woo 等[24]和Bae 等[22]分別從黃鰭金槍魚、褐籃子魚、海圓臉魚類、燕魟、赤魟和煙臺黃貂魚的背部魚皮中提取出膠原蛋白,當NaCl 質(zhì)量濃度在40 g/L 時其溶解度也表現(xiàn)出急劇下降趨勢.這也與本研究結(jié)果相似.

        3 結(jié)論

        本研究從點帶石斑魚的魚皮和魚鱗中提取出了膠原蛋白,并對這2 種膠原蛋白的理化性質(zhì)進行分析,結(jié)論如下:

        (1)魚皮中膠原蛋白的提取率遠遠大于魚鱗中的提取率,且純度也高于魚鱗中的膠原蛋白,證明魚皮更適用于提取膠原蛋白;

        (2)魚皮和魚鱗中的膠原蛋白均為Ⅰ型,含有α1、α2、β 和γ 鏈,并且具有完整的三螺旋結(jié)構(gòu),二者的氨基酸組成符合一般膠原蛋白的氨基酸組成規(guī)律;

        (3)2 種膠原蛋白都是在酸性條件和低NaCl 濃度下有較高的溶解度,符合一般膠原蛋白的溶解性特征.

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