張三鳳，趙 健，朱長軍，董智雄

（天津師范大學a.生命科學學院，b.天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387）

肺癌是一種嚴重危害人類健康的惡性腫瘤，也是發(fā)病率和死亡率最高的癌癥，近年來該病的發(fā)病率和死亡率持續(xù)上升.隨著分子生物學的發(fā)展，肺癌的治療進入了分子靶向治療的新階段，分子靶向治療已全面融入到了肺癌治療的各個階段.根據(jù)不同患者肺癌組織分子生物學方面的改變，制定個體化的治療方案將是今后的研究重點.因此，尋找新的腫瘤分子標記物用于肺癌的診斷和治療成為當前研究的熱點[1-3].

細胞染色體中，非整倍體以及染色體的不穩(wěn)定性源于有絲分裂過程中染色體的錯誤分離，常常會引起腫瘤的發(fā)生[4].紡錘體微管和著絲粒DNA 的準確連接對于染色體的正確分離至關重要，這個過程需要許多與紡錘體和著絲粒微管動力學有關的驅(qū)動蛋白參與[5].KIF4A 是一種染色體結(jié)合驅(qū)動蛋白（chromokinesin），也是一種多功能動力蛋白分子，它參與有絲分裂過程中紡錘體的形成[6]、染色體的凝集與分離[7]、DNA 的損傷應答[8]和細胞骨架的動態(tài)不穩(wěn)定性[9]等.KIF4A 蛋白分子的功能多樣性使其與人類各種重大疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關.Mazumdar 等[10]檢測KIF4A 在NCI-60（含有60 種不同人腫瘤細胞株）腫瘤細胞中的表達，發(fā)現(xiàn)35%的細胞株KIF4A 蛋白低表達或無表達，繼而應用基因敲除技術(shù)，發(fā)現(xiàn)KIF4A 無表達導致胚胎干細胞染色體超凝集化并呈現(xiàn)染色體非整倍體，在裸鼠體內(nèi)植入該胚胎干細胞后可以形成腫瘤，這充分表明KIF4A 與腫瘤的發(fā)生密切相關.Taniwaki 等[11]研究發(fā)現(xiàn)在肺癌組織中KIF4A 的mRNA 表達量高于正常組織.基于這些研究，推測KIF4A 可能與肺癌的發(fā)生發(fā)展有一定的關系.

本課題組以β-Actin（肌動蛋白）為內(nèi)參，采用實時定量PCR 的方法檢測肺癌組織和正常肺組織中KIF4A mRNA 表達水平的差異，分析其表達量與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期的關系，為進一步研究KIF4A 與肺癌的發(fā)生發(fā)展、臨床特征指標的相關性奠定基礎.

1 實驗材料與方法

1.1 組織標本

31 例肺癌組織標本和3 例正常肺組織標本均由山東大學齊魯醫(yī)院提供.其中，肺癌組織標本來源于只接受了外科手術(shù)治療的肺癌病人，包括男性24 例，女性7 例，病人的年齡、性別、癥狀和病理學類型等都來源于臨床病理記錄.肺組織標本在提取RNA 之前，均保存于液氮中.

1.2 試劑

氯仿、無水乙醇、異丙醇，天津科威公司生產(chǎn)；Trizol，寶生物工程（大連）有限公司生產(chǎn)；IMProm-IIIM 反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，美國Promega 公司生產(chǎn)；qRTPCR（SYBR Green）Kit，天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn).

1.3 實驗方法

1.3.1 總RNA 提取

切取肺癌組織和正常的肺組織各0.1～0.2 g，分別加入1 mL Trizol，按試劑說明書中的操作步驟進行RNA 提取，最后用DEPC 水進行溶解，取2 μL測定其濃度，其余的放入-80 ℃下保存.

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄PCR

取上述已測定濃度的RNA 2 μg，使用IMProm-IIIM 反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)進行反轉(zhuǎn)錄PCR，得到cDNA.反轉(zhuǎn)錄體系如下：

Ⅰ：RNA 2 μg、Oligo dT primer 1 μL、DEPC水，共11 μL，70 ℃水浴放置10 min，冰浴2 min.

Ⅱ：5×M-MLV Reverse Transcriptase Buffer 4 μL、dNTP 4 μL、M-MLV Reverse Transcriptase 1 μL，共9 μL，將Ⅱ加入Ⅰ中，共20 μL.

反轉(zhuǎn)錄循環(huán)設計：變性溫度95 ℃，時間為5 min；退火溫度42 ℃，時間為1 h；25 ℃下保溫10 min.

1.3.3 實時定量PCR（RT-PCR）

將上述反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA 用4 倍體積的高壓去離子水稀釋，進行實時定量PCR 實驗.其中β-Actin、KIF4A 的引物如下：

以1.3.2 中反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板，體系設計如下：

體系1（Actin）：水4 μL，primer1 2 μL，primer2 2 μL，模板2 μL，premix 10 μL.

體系2（KIF4A）：水4 μL，primer3 2 μL，primer4 2 μL，模板2 μL，premix 10 μL.

循環(huán)設計：第1 步，95 ℃、3 min；第2 步，95 ℃、15 s，58 ℃、20 s，68 ℃、30 s.40 個循環(huán)，每個循環(huán)結(jié)束后采集熒光信號，熒光信號強度超過基線時，記錄其閾值循環(huán)數(shù)（Ct 值），結(jié)果為3 次實驗的平均值.

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用2-ΔΔCT法計算基因的相對表達量.以正常肺組織作為對照，把對照組的表達量設為1，因此癌組織的表達量就是對照組該基因表達量的N 倍，比例代表肺癌組織與正常肺組織中KIF4A mRNA表達量的比值.采用SPSS 13.0 軟件分析各組間差異，進行T 檢驗，P ≤0.05 時表示差異有統(tǒng)計學意義.

2 結(jié)果

2.1 KIF4A 和β-Actin PCR 反應溶解曲線

用實時定量PCR 方法檢測KIF4A mRNA 在標本中的表達水平，KIF4A 和β-Actin 的溶解曲線如圖1 和圖2 所示，顯示二者基因PCR 產(chǎn)物的溶解曲線峰值都在88 ℃，溶解溫度均一，并且峰的形狀都較為銳利.這表明PCR 擴增特異性較強，無明顯的引物二聚體或其他非特異性雜帶出現(xiàn).

2.2 肺癌組織和正常肺組織中KIF4AmRNA 的表達

如圖3 所示，KIF4A mRNA 在正常肺組織和肺癌組織中都有表達，且31 例肺癌組織中有29 例的KIF4A mRNA 表達水平高于正常組織，其中26 例（83.87%）比正常組織高2 倍以上，10 例（32.30%）比正常組織高4 倍以上.由此可見，肺癌組織中KIF4A mRNA 的表達水平顯著高于正常組織，二者之間的差異具有統(tǒng)計學意義（P≤0.01）.

2.3 肺癌組織中KIF4A mRNA 表達與臨床病理特征的相關性分析

肺癌組織標本的檢測信息結(jié)果如表1 所示.從表中可以看出，在鱗癌與腺癌中，KIF4A mRNA 表達量的差異不具有統(tǒng)計學意義（F=0.615，P=0.863）.KIF4A mRNA 的表達量與肺癌組織分化程度之間（F=1.214，P=0.882）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間（F=1.153，P=0.739）的差異也不具有統(tǒng)計學意義.但KIF4A mRNA 的表達量在TNM 分期之間的差異具有統(tǒng)計學意義，TⅡ中的表達量要顯著高于TⅠ中的表達量（F=0.565，P=0.029）.

表1 KIF4A mRNA 的表達量與肺癌各臨床特征之間的關系Tab.1 Relationship between expression of KIF4A mRNA and lung cancer clinicopathological characteristics

3 討論與結(jié)論

Taniwaki 等研究證實，采用RNAi（RNA 干涉）的方法沉默KIF4A 基因表達后，與正常細胞相比，肺癌細胞的生長受到明顯抑制[8]，這說明KIF4A 可能是肺癌細胞生長過程中一個重要的生長因子.本研究通過對肺癌組織和正常組織中KIF4A mRNA表達水平的檢測和比較，發(fā)現(xiàn)在肺癌組織中KIF4A mRNA 的表達水平顯著高于正常組織，表明KIF4A mRNA 的表達量與肺癌的發(fā)生發(fā)展有明確的相關性.Taniwaki 等的研究進一步證實KIF4A 的表達量對肺癌細胞的侵襲有一定的影響[8]，由此推測KIF4A可能通過影響細胞的侵襲功能而發(fā)揮致癌作用，但KIF4A 表達量增高的具體分子機制尚不清楚.臨床病理因素分析表明，KIF4A mRNA 的表達量與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理組織類型和肺癌細胞分化程度的差異不具有統(tǒng)計學意義，KIF4A mRNA 的表達量在TNM 分型中的差異有統(tǒng)計學意義，在TⅡ中KIF4A mRNA 的表達量顯著高于TⅠ.而T 分型與病人的遠期預測即存活率有關，意味著KIF4A 可能與肺癌的預后（存活可能概況）存在一定的相關性.

綜上所述，KIF4A 可能成為肺癌的新型標記分子和治療靶標，同時也可以作為其預后的標志分子.

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