趙翠娟 ，宋文軍，朱高雄，魏紀(jì)平，李博志 宋瓘蘭，閆春燕，龔 忱

（1.天津商業(yè)大學(xué) 生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134；2.天津市興源環(huán)境技術(shù)工程有限公司，天津 300384；3.天津清鑒生物科技有限公司，天津 300384）

氮循環(huán)是水體循環(huán)的重要組成部分，其中氨氮是造成水體污染的主要污染物之一，同時(shí)也是引起水體富營養(yǎng)化和減弱水體自凈能力的主要原因之一[1].因此，降解污水中的氨氮對(duì)維持水體清潔具有重要意義[2].生物脫氮技術(shù)作為去除污水中氮素污染的最有效方法成為水處理領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)[3-5]，目前被認(rèn)為是具有較高可行性和最有前途的水體脫氮方法.傳統(tǒng)的生物脫氮由硝化作用和反硝化作用共同完成[6]，硝化作用又包括2 個(gè)步驟：將氨轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽和亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為硝酸鹽.這2個(gè)步驟分別由亞硝化細(xì)菌和硝化細(xì)菌完成[7-8]，這一領(lǐng)域的研究較多[9-11].硝化細(xì)菌在生物硝化脫氨中起主要作用，它直接影響硝化的效果和生物脫氨的效率[12].但僅采用傳統(tǒng)方法篩選硝化細(xì)菌還遠(yuǎn)不能達(dá)到當(dāng)前的社會(huì)需求，而且耗費(fèi)時(shí)間長、效率低.因此，高效快速地篩選硝化細(xì)菌是目前急需解決的問題.

在此背景下，本課題組研究了一種新型的硝化細(xì)菌的篩選方法，該方法不但達(dá)到了快速篩選的目的，最重要的是還能高通量篩選硝化細(xì)菌，這對(duì)于后續(xù)的污水處理具有理論和現(xiàn)實(shí)意義.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣品

該研究的污水樣品取自天津市紀(jì)莊子污水處理廠的曝氣池，篩選出的菌株以“JZZ-”開頭、依次用阿拉伯?dāng)?shù)字1～100 對(duì)其進(jìn)行命名，順序隨機(jī)而定，無特殊含義.氨氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮的鑒定用氨氮、亞硝酸鹽、硝酸鹽快速測定試劑盒測定，該試劑盒由北京蘭康保技術(shù)有限公司提供.

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)基：（NH4）2SO40.496 g，KH2PO40.825 g，Na2HPO41.032 g，MgSO·47H2O 1.6 g，CaCl2·2H2O 0.2 g，C6H6O61.8 g，CaCO36.4 g，NaHCO30.078 g，微量元素Ⅰ（FeSO44 g，EDTA 4 g），微量元素Ⅱ（EDTA 1.2 g，ZnSO4·7H2O 0.52 g，CoCl·6H2O 0.25 g，MnCl20.724 g，CuSO4·5H2O 0.24 g，Na2MoO4·2H2O 0.32 g，NiCl·26H2O 0.18 g，H3BO30.016 g），蒸餾水1 000 mL，pH 值為8.0～8.2（用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的碳酸鈉和鹽酸調(diào)pH 值）.

（2）硝化細(xì)菌分離培養(yǎng)基：（NH4）2SO40.496 g，KH2PO40.825 g，Na2HPO41.032 g，MgSO4·7H2O 1.6 g，CaCl2·2H2O 0.2 g，NaHCO30.078 g，余同（1）.

（3）硝化細(xì)菌鑒定培養(yǎng)基：（NH4）2SO40.496 g，CH3COONa 8 g，KH2PO40.825 g，Na2HPO41.032 g，MgSO4·7H2O 1.6 g，CaCl2·2H2O 0.2 g，NaHCO30.078 g，余同（1）.

以上所用培養(yǎng)基若是固體培養(yǎng)基則加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.7%～2.0%的瓊脂，且都在115 ℃條件下滅菌25 min.

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的馴化

取污水樣品100 mL 倒入三角瓶中，每隔6 h替換1 次人工培養(yǎng)基，加入培養(yǎng)基的量依次為0、20%、40%、60%、80%、100%，置于27 ℃、170 r/min下振蕩培養(yǎng).

1.2.2 硝化細(xì)菌的初篩

將菌液進(jìn)行梯度稀釋，選取3 個(gè)濃度梯度1.0×104、1.0×105、1.0×106涂布到固體分離培養(yǎng)基上（每個(gè)稀釋度做3 個(gè)重復(fù)），30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.再從涂布的平板上挑取菌落在固體分離培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分純，30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，重復(fù)此步驟，直到得到單菌落為止.以上操作均在無菌條件下進(jìn)行.

1.2.3 硝化細(xì)菌的富集

用接種環(huán)將初篩的單菌落接種到裝有0.8 mL富集培養(yǎng)基的菌株富集管中，將菌株富集管蓋擰緊裝入凍存盒，再將其平放入搖床，30 ℃、170 r/min下振蕩培養(yǎng)24 h.

1.2.4 高通量驗(yàn)證硝化細(xì)菌

微孔板顯色鑒定法：取無菌的裝有鑒定培養(yǎng)基的96 孔深孔培養(yǎng)板，用排槍向每孔接入20 μL 富集菌液，28 ℃、150 r/min 下振蕩培養(yǎng)24 h，不加菌液的裝有鑒定培養(yǎng)基的孔作為空白對(duì)照組.

氨氮、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮的快速測定方法：本方法為氨氮試劑盒、硝酸鹽和亞硝酸鹽試劑盒對(duì)菌液進(jìn)行快速目視半定量鑒定.根據(jù)試劑盒中的指示向裝有菌液的孔中滴加氨氮試劑（Ⅰ）1 滴，震蕩均勻，再滴加氨氮試劑（Ⅱ）1 滴，搖勻放置5 min，自上而下與該試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)比色卡根據(jù)顏色深淺測定菌液中的氨氮，深黃色用“++”表示，淺黃色用“+”，顏色無變化則為陰性，用“-”表示.同樣的方法，向孔中加入1 小勺亞硝酸鹽試劑，搖動(dòng)使其溶解，靜置5 min 后，進(jìn)行目視比色，深紅色用“++”表示，淺紅色或粉紅色用“+”，顏色無變化則為陰性，用“－”表示.向孔中加入1 小勺硝酸鹽試劑，振搖1 min，放置15 min 測定出硝態(tài)氮的含量，深紅色用“++”表示，淺紅色或粉紅色用“+”，顏色無變化則為陰性，用“－”表示.這種方法能同時(shí)鑒定幾十株甚至上百株硝化細(xì)菌，實(shí)現(xiàn)對(duì)硝化細(xì)菌的高通量、快速篩選.

1.2.5 硝化細(xì)菌的保存

向菌株富集管中剩余的菌液中加入等體積的體積分?jǐn)?shù)為40%的甘油，震蕩均勻，放入－20 ℃冰箱保存.

1.2.6 復(fù)篩

將初篩得到的硝化細(xì)菌進(jìn)行復(fù)篩，即將篩選到的硝化細(xì)菌接到化學(xué)需氧量（COD）為167 mg/L、氨氮為86 mg/L 的市政污水中，將其放入搖床，在28 ℃、170 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)24 h，再用國標(biāo)法測定COD 和氨氮的降解率[13-14].

2 結(jié)果與分析

2.1 初篩

通過分離培養(yǎng)基篩選出了94 株單菌，將這些單菌分別接到裝有鑒定培養(yǎng)基的96 孔深孔培養(yǎng)板中，然后用各試劑盒對(duì)氨氮、亞硝酸鹽、硝酸鹽進(jìn)行驗(yàn)證，有41 株菌被初步確定為硝化細(xì)菌，它們具體的硝化特性如表1 所示.

表1 41 個(gè)菌株的硝化特性Tab.1 Nitrification characteristics of 41 strains

2.2 復(fù)篩

將初篩得到的41 株硝化細(xì)菌按1.2.6 復(fù)篩方法處理，再對(duì)其進(jìn)行功能驗(yàn)證，得到25 株高效的硝化細(xì)菌，其COD 和氨氮降解率如表2 所示.

表2 25 個(gè)菌株對(duì)污水中COD 和氨氮的降解效率Tab.2 Decomposition efficiency of COD and ammonia nitrogen in sewage of 25 strains

由表2 可知，JZZ-13、JZZ-49、JZZ-64 和JZZ-90 菌株處理污水的效果最好.

3 結(jié)論

本課題組首先通過分離培養(yǎng)基篩選出94 株單菌，再用氨氮、亞硝酸鹽、硝酸鹽試劑盒初步篩選出41 株硝化細(xì)菌.該方法大大降低了用傳統(tǒng)方法直接篩選單菌的工作量，縮短了菌種篩選的時(shí)間.繼而對(duì)這些菌進(jìn)行功能驗(yàn)證，復(fù)篩得到了25 株對(duì)污水中的COD 和氨氮降解效果好的硝化細(xì)菌.因此，這25 株硝化細(xì)菌對(duì)污水的處理有很重要的應(yīng)用價(jià)值.同時(shí)，課題組還研究了一種利用96 孔板和試劑盒高通量快速篩選硝化細(xì)菌的方法，能同時(shí)篩選出幾十株甚至上百株硝化細(xì)菌，這在很大程度上降低了工作量，提高了工作效率.

[1]李靜，王文文，梁磊，等.耐鹽好氧反硝化菌篩選及其反硝化特性的研究[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2011，34（6）：48—52.

[2]KENNISH M J.Environmental threats and environmental future of estuaries[J].Environ Conserv，2002，29（7）：78—107.

[3]竇立軍，蔣進(jìn)元，黃永亨，等.兩株自養(yǎng)型氨氧化細(xì)菌的分離、鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析[J].環(huán)境科學(xué)研究，2011，24（11）：1312—1313.

[4]李帆，莢榮，查誠.脫氮菌株P(guān)6 的分離鑒定及其處理氨氮廢水的試驗(yàn)研究[J].生物技術(shù)，2007，17（5）：64—68.

[5]段慧源，趙樹蘭，多立安.生態(tài)塘組合工藝在天津?yàn)I海新區(qū)城市污水處理中的應(yīng)用策略[J].天津師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，30（2）：62—66.

[6]汪蘋，王斌，劉軍.同步硝化反硝化處理氨氮廢水過程中氣態(tài)脫氮產(chǎn)物的研究[J].環(huán)境科學(xué)研究，2005，18（5）：67—71.

[7]胡君利，林嫌貴，褚海燕，等.土壤氨氧化細(xì)菌的分離方法研究[J].土壤，2005，37（5）：569—571.

[8]INNEREBNER G，KNAPP B，VASARA T，et al.Traceability of ammonia-oxidizing bacteria in compost-treated soils [J].Soil Biology&Biochemistry，2006，38（5）：1092—1100.

[9]王成林，周巧紅，王亞芬，等.一株異養(yǎng)硝化細(xì)菌的分離鑒定及其亞硝化作用研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2008，27（3）：1146—1150.

[10]曾慶武，梁運(yùn)祥，葛向陽.反硝化細(xì)菌的分離篩選及其反硝化特性的初步研究[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2008，27（5）：616—620.

[11]EBRU C，MEHMET A K.Isolation and characterization of aerobic denitrifiers from agricultural soil[J].Turkish Journal of Biology，2004，28（1）：9—14.

[12]黃玨.硝化細(xì)菌的分離和鑒定[J].水產(chǎn)科技情報(bào)，2004，31（3）：130—131.

[13]國家環(huán)境保護(hù)總局科技標(biāo)準(zhǔn)司.HJ/T 399-2007，水質(zhì)化學(xué)需氧量的測定快速消解分光光度法[S].北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社，2007.

[14]國家環(huán)境保護(hù)部科技標(biāo)準(zhǔn)司.HJ 535-2009，水質(zhì)氨氮的測定納氏試劑分光光度法[S].北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社，2009.