龍洪清

(湖北科技學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)與核醫(yī)學(xué)教研室，湖北咸寧437100)

惡性腫瘤包括肝癌在內(nèi)的實(shí)體瘤主要依賴(lài)新血管的生成以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移對(duì)機(jī)體構(gòu)成嚴(yán)重危害。因此，針對(duì)新生血管生成治療，是針對(duì)包括肝癌在內(nèi)的惡性腫瘤進(jìn)行治療的一個(gè)重要策略［1，2］。內(nèi)皮抑素(Endostatin)對(duì)體外內(nèi)皮細(xì)胞增殖具有明顯抑制活性，體內(nèi)亦可特異性抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和新生血管形成，抑制腫瘤生長(zhǎng)。惡性腫瘤治療方法中基因治療是近些年研究較熱的一種重要方法。如何準(zhǔn)確有效將外源基因?qū)霅盒阅[瘤細(xì)胞，是有效治療腫瘤的關(guān)鍵技術(shù)。病毒載體中腺病毒是被證明最有前途的基因治療載體。本實(shí)驗(yàn)利用已成功構(gòu)建的內(nèi)皮抑素重組腺病毒Ad-endostatin［3］，用HUVEC 細(xì)胞觀察抑制作用，用裸鼠制備HepG2肝癌細(xì)胞荷瘤模型，通過(guò)瘤內(nèi)注射Ad-endostatin，了解其對(duì)腫瘤血管生成的抑制作用，為臨床實(shí)施重組基因技術(shù)治療惡性腫瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

HUVEC 細(xì)胞，HepG2細(xì)胞，購(gòu)自武漢大學(xué)生命科學(xué)細(xì)胞庫(kù);雌性BALB/C 裸鼠，6～8周齡，體質(zhì)量20g 左右，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 方法

1.2.1 MTT 法觀察Ad-endosatin 對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

HUVEC 細(xì)胞種植于96孔板中，每孔1×104細(xì)胞，置于37℃5%CO2孵箱培養(yǎng)過(guò)夜。設(shè)Ad-Endo 感染組、Ad-EGFP 感染組(Mock 組)和未處理組(PBS 組)。待培養(yǎng)細(xì)胞貼壁后再感染細(xì)胞。Ad-Endo 感染組分別加入10、50感染復(fù)數(shù)(MOI)的Ad-Endo 病毒感染1h，換液繼續(xù)培養(yǎng)，分別于24、48h 后，用無(wú)菌槍尖吸去培養(yǎng)液。以完全培養(yǎng)基稀釋MTT，終濃度為5mg/ml，每孔加入10μl，將細(xì)胞放回5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4h，再吸去含MTT 的培養(yǎng)基，每孔加入150μl 二甲亞砜(DMSO)，用酶標(biāo)儀在490nm 波長(zhǎng)處讀取吸收值。Ad-EGFP 感染組分別加入10、50MOI Ad-EGFP，方法同Ad-Endo 感染組。以PBS 組的吸收值為100%作對(duì)照，檢測(cè)細(xì)胞活性，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

1.2.2 動(dòng)物模型的建立與治療作用觀察

雌性BALB/C-nu 裸小鼠共15只，作為可移植性肝癌HepG2腫瘤模型宿主。所有裸鼠均飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)無(wú)菌隔離小籠。于裸鼠皮下接種約5×106個(gè)腫瘤細(xì)胞，接種9d 后(腫瘤大小約100mm3)，將小鼠隨機(jī)分為3組:PBS 對(duì)照組、Ad-EGFP 組、Ad-Endo 治療組，每組小鼠5只。分組后開(kāi)始進(jìn)行瘤內(nèi)注射治療。治療組采用Ad-Endo 2×109Pfu/100μl PBS，每隔3d 瘤內(nèi)多點(diǎn)注射1次;Ad-EGFP 組采用Ad-EGFP 2×109Pfu/100μl PBS，PBS 對(duì)照組采用100μl PBS。觀察腫瘤體積生長(zhǎng)變化。每3d 1次稱(chēng)重小鼠，用游標(biāo)卡尺測(cè)量皮下腫瘤最大經(jīng)(a)最小經(jīng)(b)，計(jì)算腫瘤體積V=ab2/2，取均值繪制腫瘤體積變化曲線(xiàn)。

1.2.3 腫瘤組織微血管密度觀察

治療21d 后處死小鼠，迅速取出腫瘤組織，10%中性甲醛固定。采用常規(guī)ABC 免疫組織化學(xué)染色方法，所選一抗為大鼠抗小鼠CD31單克隆抗體，二抗為生物素標(biāo)記的兔抗大鼠IgG。腫瘤組織平均血管密度(MVD)以血管內(nèi)皮細(xì)胞CD31抗原表達(dá)程度判斷。在顯微鏡下計(jì)數(shù)6個(gè)高倍鏡(200倍)視野中CD31陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，每個(gè)視野平均數(shù)為MVD。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)采用SPSS 13.0軟件包計(jì)算處理。資料差異比較采用t檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均以а=0.05為標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖抑制分析

MTT 法檢測(cè)HUVEC 細(xì)胞感染后的細(xì)胞活性。Ad-EGFP 感染組(Mock 組)和未處理組(PBS組)的細(xì)胞僅僅出現(xiàn)較弱的非特異細(xì)胞增殖抑制。Ad-Endo 感染組明顯抑制HUVEC 細(xì)胞增殖。當(dāng)使用10 MOI 的病毒時(shí)，感染24、48h 后的細(xì)胞活性分別為(87.61±4.59)%、(81.48±3.88)%;當(dāng)使用50 MOI 的病毒時(shí)，感染24、48h 后的細(xì)胞活性分別下降到(79.30±3.76)%、(63.75±2.82)%，如圖1A。感染復(fù)數(shù)增加，感染時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞活性明顯下降，t=3.132，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Ad-Endo 感染組中檢測(cè)到Endostatin 蛋白在靶細(xì)胞中的表達(dá)，如圖1B 所示。

圖1 HUVEC 細(xì)胞活性變化

2.2 體內(nèi)腫瘤治療實(shí)驗(yàn)結(jié)果

裸鼠皮下腫瘤組織體積變化，如圖2顯示，Ad-Endo 治療組小鼠皮下腫瘤組織均出現(xiàn)了一定的治療效果，治療21d 后，PBS 對(duì)照組腫瘤體積895±44mm3，Ad-EGFP 組683±33mm3，Ad-Endo治療組435±26mm3，與PBS 對(duì)照組相比，Ad-Endo治療組腫瘤生長(zhǎng)體積抑制率達(dá)到51.40%，t=19.819，差異具有顯著性(P＜0.001)。

圖2 BALB/c 荷瘤裸鼠腫瘤生長(zhǎng)體積變化曲線(xiàn)

2.3 腫瘤組織微血管密度檢測(cè)結(jié)果

免疫組織化學(xué)檢測(cè)腫瘤組織切片中的腫瘤微血管生成情況，如圖3所示。結(jié)果顯示在Ad-Endo 治療組，小鼠腫瘤切片中腫瘤組織微血管生成明顯減少，每個(gè)高倍鏡視野平均CD31陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)MVD 為68.34±3.29，明顯低于Ad-EGFP 組96.06±4.38和PBS 對(duì)照組113.28±5.20，t=12.600，差異具有顯著性(P＜0.001)。

圖3 腫瘤組織切片CD31表達(dá)的免疫組化分析

(A)、(B)和(C)分別為用PBS、Ad-EGFP 和Ad-Endo治療荷瘤小鼠腫瘤組織石蠟切片ABC 法免疫組化染色。在顯微鏡下觀察CD31陽(yáng)性細(xì)胞(棕色)。(200×)

3 討論

腫瘤新血管的生成為正在生長(zhǎng)的腫瘤獲得足夠的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，這對(duì)于腫瘤來(lái)說(shuō)非常重要。Folkman 等［4］證明除非有新血管生成，否則腫瘤不可能超過(guò)幾毫米。血管生成因子和抗血管生成因子之間的平衡控制新血管的生成。目前，已經(jīng)鑒定了各種不同的血管生成因子和血管生成抑制因子，其中一些血管生成因子或抑制因子通過(guò)分子生物技術(shù)改造，逐步進(jìn)入臨床試驗(yàn)或臨床應(yīng)用階段。

內(nèi)皮抑素(Endostatin)由膠原蛋白XⅧ的羧基末端非膠原區(qū)內(nèi)的184個(gè)氨基酸構(gòu)成，其分子量為20KD，是眾多內(nèi)源性血管形成抑制因子之一，它的出現(xiàn)曾經(jīng)在生物學(xué)界引起巨大轟動(dòng)。其特點(diǎn)是:①大劑量給藥也不引起毒性和不良反應(yīng);②每天靜脈滴注不同劑量的Endostatin，可見(jiàn)腫瘤內(nèi)血流和代謝明顯下降;③Endostatin 不影響生理性創(chuàng)傷愈合，但可抑制病理性血管形成。有研究表明，將Lewis 肺腫瘤移植到鼠體內(nèi)，生長(zhǎng)至100～200mm3時(shí)用Endostatin 進(jìn)行全身性治療，能有效地抑制原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)，劑量愈大，效用愈強(qiáng)。為使腫瘤持續(xù)消退并維持于休眠狀態(tài)，內(nèi)皮抑素必須長(zhǎng)期應(yīng)用。但是其理化性質(zhì)活潑，不穩(wěn)定，易變性;分離提純過(guò)程復(fù)雜，大量制備比較困難。因此，制約了其大量生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用。然而，基因重組導(dǎo)入治療技術(shù)可以避免大量制備內(nèi)皮抑素比較困難的難題，為腫瘤治療提供了新思路和新方法。楊志廣等人［5］構(gòu)建了帶有分泌信號(hào)的內(nèi)皮抑素原核表達(dá)載體pFLAG-ssEndostatin。于磊等人［6］構(gòu)建了腺相關(guān)病毒(rAAV)-腫瘤內(nèi)皮抑素(tumstatin)載體rAAV-Tum，體外實(shí)驗(yàn)表明該病毒能高效誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。筆者［3］成功構(gòu)建人內(nèi)皮抑素重組腺病毒Ad-endostatin，實(shí)驗(yàn)表明它使HEK293細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變效應(yīng)。本研究利用已構(gòu)建成功的重組腺病毒Ad-endostatin，觀察其對(duì)HUVEC 細(xì)胞增殖的抑制作用。實(shí)驗(yàn)表明感染復(fù)數(shù)增加，感染時(shí)間延長(zhǎng)，抑制作用明顯增強(qiáng)。

對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞進(jìn)行直接殺滅或抑制作用是對(duì)腫瘤進(jìn)行有效治療的重要方式。王榮等人［7］用帶有內(nèi)皮抑素基因真核細(xì)胞表達(dá)載體質(zhì)粒導(dǎo)入裸鼠ACHN 腎細(xì)胞癌(RCC)細(xì)胞中，結(jié)果內(nèi)皮抑素表達(dá)質(zhì)粒能顯著抑制裸鼠ACHN 的RCC 腫瘤體積增長(zhǎng)。Li S 等人［8］用人工合成內(nèi)皮抑素核苷酸序列編碼25-31氨基酸，Peptide 30，觀察到能夠有效抑制HepG2腫瘤細(xì)胞黏附、侵襲和遷移。本實(shí)驗(yàn)采用重組腺病毒Ad-Endo，瘤內(nèi)注射治療HepG2肝癌細(xì)胞制備的裸鼠腫瘤模型，采用多時(shí)間點(diǎn)注射，對(duì)肝癌腫瘤組織生長(zhǎng)抑制率達(dá)到51.40%。進(jìn)一步說(shuō)明內(nèi)皮抑素對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)具有明顯抑制作用。機(jī)制可能是由于重組腺病毒Ad-Endo 具有感染效率高的特點(diǎn)，能夠有效將目的基因轉(zhuǎn)入腫瘤組織細(xì)胞中，通過(guò)持續(xù)表達(dá)內(nèi)皮抑素，對(duì)裸鼠皮下接種HepG2肝癌細(xì)胞增殖生長(zhǎng)具有明顯抑制作用，而且作用持久。更可能是與內(nèi)皮抑素抑制腫瘤組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡有關(guān)，使腫瘤細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)缺乏數(shù)量減少，在總體上表現(xiàn)為腫瘤生長(zhǎng)變慢、體積縮小。

CD31是血管內(nèi)皮細(xì)胞的重要標(biāo)記。Xie L等［9］研究了腫瘤血管生成過(guò)程中內(nèi)生血管生成抑制劑(EAIs)的作用，進(jìn)一步驗(yàn)證了血管生成平衡假說(shuō)理論。本實(shí)驗(yàn)中，在Ad-Endo 治療組，用免疫組化染色顯示肝癌組織中血管生成明顯減少，每6個(gè)高倍鏡視野中平均CD31陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)68.34，明顯低于Ad-EGFP 組(96.06)和PBS 對(duì)照組(113.28)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明腺病毒介導(dǎo)的內(nèi)皮抑素，明顯抑制腫瘤模型中腫瘤組織新生血管的生成，打破了血管生成平衡，為進(jìn)行內(nèi)皮抑素基因治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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