魏 強(qiáng)， 方 亮， 楊繼金， 霍寧寧， 呂 虎， 熊源長， 江 旭， 李 慧

目前，醫(yī)用臭氧（O3）在國際上已廣泛用于創(chuàng)傷或褥瘡愈合、外周動脈包括心腦動脈阻塞性疾病、糖尿病足、口腔疾病、病毒性肝炎、化膿性膽管炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)疼痛等輔助治療，在我國尤其在椎間盤突出癥的治療上取得了非常明顯的療效［1-2］。1980 年，Sweet等［3］在《Science》雜志上報道了臭氧在體外具有抑制人類腫瘤細(xì)胞生長的作用，然而近30年來，臭氧在腫瘤治療方面的研究卻很少［4-7］，并且多為臭氧對機(jī)體免疫功能調(diào)節(jié)作用的研究［4，8-10］。2008年 Schulz等［5］報道，通過腹腔內(nèi)注射臭氧，可以使部分荷瘤新西蘭大白兔的VX2瘤完全消失，但這一結(jié)果遭到質(zhì)疑［11］。 張學(xué)彬等［6］采用臭氧化碘油經(jīng)肝動脈灌注栓塞治療兔VX2瘤，取得了較好的療效。管京樂和汪蓓蓓［12］通過瘤內(nèi)直接注射不同濃度臭氧治療兔VX2瘤，也取得了一定的療效。本實(shí)驗(yàn)旨在通過對兔VX2瘤內(nèi)直接注入不同濃度臭氧，觀察不同時間腫瘤組織超微結(jié)構(gòu)的改變，以判斷不同濃度臭氧對腫瘤細(xì)胞的殺傷程度。

1 材料與方法

1.1 兔VX2瘤模型制作

取體重2.5～3 kg的新西蘭大白兔20只，雌雄不限，由第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供。兔VX2瘤株由復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院介入放射科惠贈（種植成功的荷瘤大白兔）。以0.03 g/kg戊巴比妥耳緣靜脈麻醉成功后，將荷瘤兔仰臥縛于專用手術(shù)臺上，腹股溝處剪毛，安爾碘消毒后切開皮膚剝離腫瘤，取魚肉樣瘤組織置生理鹽水中洗滌2次，剪碎并制成1 mm大小瘤塊，接種于實(shí)驗(yàn)兔后腿內(nèi)側(cè)肌肉內(nèi)，2周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及取材

20只兔共分4組，對照組2只，T20（20%臭氧）、T40（40%臭氧）和 T60組（60%臭氧）各 6 只，其中對照組及各治療組取2只兔在實(shí)驗(yàn)完成后即刻取材。方法：按前述靜脈麻醉、消毒，直視下切開瘤區(qū)皮膚，用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長短經(jīng)，按照公式V=1/2a×b2計算腫瘤體積［6］，并按腫瘤體積 2倍量不同濃度的O2/O3混合氣體用注射器直接注入瘤體內(nèi)，為減少對腫瘤組織的擠壓而引起超微結(jié)構(gòu)改變，即刻處死取材的實(shí)驗(yàn)兔均沿腫瘤長徑單次穿刺注射，對照組兔僅穿刺腫瘤而不注射氣體，沿針道切開腫瘤，取針道周圍的瘤組織，置于放有4℃專用固定液（2.5%戊二醛）的硬紙板上，切成0.5 mm大小的組織塊，并置于固定液內(nèi)固定，冷藏備用。T20、T40、T60組各剩余4只兔按腫瘤體積2倍量直視下用注射器多點(diǎn)穿刺注射不同濃度的O2/O3混合氣體，以盡量使臭氧彌散到全部腫瘤組織，然后縫合皮膚、消毒，再放入籠內(nèi)飼養(yǎng)，分別于術(shù)后第4、8天各處死2只，按前述方法取材、固定保存。臭氧發(fā)生器由德國Humares公司制備。

1.3 制片及電鏡觀察

將冷藏固定2 h以上的標(biāo)本用緩沖液漂洗后置1% 四氧化鋨中固定2 h，再次漂洗，逐級脫水后，包埋于Epon812中，常規(guī)聚合、切片、鈾鉛染色，置銅網(wǎng)上用Hitachi76透射電鏡觀察，放大倍數(shù)7 500～25 000。

2 結(jié)果

電鏡觀察可見對照組細(xì)胞核、細(xì)胞膜完整，線粒體較小且少、密度增高，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)尚完整（圖1），部分腫瘤細(xì)胞退行性變、壞死。腫瘤內(nèi)的小血管完整。與對照組相比，T20組注射臭氧后即刻可見腫瘤細(xì)胞有輕微損傷，表現(xiàn)為線粒體輕微嵴溶解，少許線粒體呈球狀腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，部分核周間隙增寬（圖2）。類似改變可以延續(xù)至術(shù)后第4、8天，但總體改變較輕微，細(xì)胞間隙正常。T40組注射臭氧后即刻可見腫瘤細(xì)胞有明顯損傷改變，表現(xiàn)為線粒體明顯腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，細(xì)胞核腫脹，核周間隙增寬，部分細(xì)胞膜崩裂（圖3），組織結(jié)構(gòu)崩解。血管內(nèi)皮細(xì)胞異染色質(zhì)少。術(shù)后第4天，可見大片壞死，腫瘤細(xì)胞膜不完整，溶酶體線粒體形成（呈新月形黑顆粒）或線粒體溶解，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，部分胞質(zhì)溶解，細(xì)胞核不規(guī)則，核周間隙擴(kuò)張（圖4）。術(shù)后第8天，仍可看到細(xì)胞間隙明顯增寬，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，線粒體密度增高、形狀不規(guī)則，提示損傷已部分恢復(fù)。T60組注射臭氧后即刻也可見腫瘤細(xì)胞有明顯的損傷改變，表現(xiàn)為線粒體密度增高，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，細(xì)胞核腫脹，細(xì)胞間隙明顯增寬，部分細(xì)胞崩解。第4天，組織溶解，細(xì)胞分辨不清，可見白細(xì)胞浸潤（比T40組更明顯），炎細(xì)胞內(nèi)可見嗜酸、嗜堿顆粒（圖5）。瘤周血管內(nèi)皮細(xì)胞外膜分離，胞質(zhì)內(nèi)見空泡變（圖6）。第8天，仍然可見大片組織崩解，細(xì)胞較分散，線粒體呈球狀腫脹，崩解細(xì)胞及相對正常細(xì)胞溶酶體內(nèi)有高密度影，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴(kuò)張。

圖1 對照組細(xì)胞核、細(xì)胞膜完整，線粒體較小且少、密度增高，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)尚完整

圖2 T20組注射后即刻少許線粒體呈球狀腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，部分核周間隙增寬

圖3 T40組注射后即刻線粒體明顯腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，細(xì)胞核腫脹，核周間隙增寬，細(xì)胞膜崩裂

圖4 T40組注射后第4天，腫瘤細(xì)胞膜不完整，溶酶體線粒體形成（黑顆粒），部分胞質(zhì)溶解，細(xì)胞核不規(guī)則，核周間隙擴(kuò)張

圖5 T60組注射后第4天，組織溶解，腫瘤細(xì)胞分辨不清，可見白細(xì)胞浸潤

圖6 T60組注射后第4天，瘤周血管內(nèi)皮細(xì)胞外膜分離，胞質(zhì)內(nèi)見空泡變

3 討論

醫(yī)用臭氧在臨床上應(yīng)用已有100多年，但在腫瘤防治方面的應(yīng)用研究僅為40余年，且多以離體實(shí)驗(yàn)為主，在體研究較少。臨床上也僅將臭氧作為輔助治療手段，從刺激相關(guān)細(xì)胞因子的合成與釋放、提高機(jī)體免疫功能角度，達(dá)到增強(qiáng)抗腫瘤的效果。事實(shí)上，臭氧作為強(qiáng)氧化劑，很容易游離出1個原子氧 （初生態(tài)氧），與有機(jī)分子反應(yīng)產(chǎn)生自由基，而使細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化作用，生成的過氧化脂質(zhì)及其分解產(chǎn)物丙二醛使蛋白質(zhì)分子交聯(lián)，影響酶活性，對細(xì)胞膜和細(xì)胞器造成損傷，從而直接殺滅腫瘤細(xì)胞（與消毒殺滅微生物類似）。目前，有關(guān)醫(yī)用臭氧對髓核組織超微結(jié)構(gòu)的影響已有報道［13］，但對其直接作用于腫瘤組織造成其損傷的形態(tài)學(xué)改變尚少見報道。

從本研究可見，臭氧對腫瘤細(xì)胞具有即刻的損傷、殺滅作用，并且隨著濃度的提高而增強(qiáng)。20%臭氧對腫瘤細(xì)胞只是造成了比較輕微的損傷，線粒體輕微嵴溶解，少許呈球狀腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，部分核周間隙增寬，并未見大片腫瘤壞死，而40%的臭氧則直接對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生了明顯的損傷，可見線粒體明顯腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，細(xì)胞核腫脹，核周間隙增寬，部分細(xì)胞膜崩裂，組織結(jié)構(gòu)崩解。術(shù)后第4天可見腫瘤細(xì)胞膜不完整，溶酶體線粒體形成或線粒體溶解，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，部分胞質(zhì)溶解，細(xì)胞核不規(guī)則，核周間隙擴(kuò)張，術(shù)后第8天仍有類似改變，但逐漸恢復(fù)。60%的臭氧對腫瘤造成的損傷較40%更明顯，壞死區(qū)周圍的炎細(xì)胞浸潤也更明顯。以上不同濃度的臭氧對腫瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，在術(shù)后第8天仍然可見，但與第4天相比已有所減輕，提示正在恢復(fù)。除了腫瘤細(xì)胞本身外，腫瘤組織內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞也有損傷，表現(xiàn)為胞核內(nèi)異染色質(zhì)減少、胞質(zhì)內(nèi)空泡形成及細(xì)胞外膜分離，這意味著腫瘤內(nèi)微循環(huán)會發(fā)生障礙，從而影響腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)及代謝產(chǎn)物的排出，增加腫瘤組織的壞死。

綜上所述，單純從兔VX2瘤內(nèi)注射不同濃度臭氧后腫瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變來看，40%～60%臭氧都可以起到很好的治療作用，但綜合考慮安全性和治療效果，可能40%臭氧更好一些，因?yàn)樵谖覀円酝母闻K動物實(shí)驗(yàn)中，觀察到在注射高濃度的臭氧時，偶有突然死亡案例發(fā)生。另外，如果應(yīng)用于臨床，肯定需要多次、重復(fù)治療，而治療間隔以4～8 d為宜。

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