王連蘭 郭小紅

1 供試品、培養(yǎng)基、器材及菌種

1.1 供試品 鹽酸阿撲嗎啡鼻噴劑批號(hào):110417由浙江濟(jì)民制藥股份有限公司提供(注:驗(yàn)證試驗(yàn)采用一批供試品三次獨(dú)立的平行試驗(yàn))

1.2 培養(yǎng)基 脂培養(yǎng)基(批號(hào)101130);玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)110808);改良馬丁培養(yǎng)基(批號(hào)1105242);改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)100622);膽鹽乳糖培養(yǎng)基(批號(hào)100031);營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號(hào)100628);甘露醇氯化鈉培養(yǎng)基(批號(hào)100825);硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基(批號(hào)110311);4-甲基傘形酮葡糖苷酸(MUG)培養(yǎng)基(批號(hào):091029);麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)100125);溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào):101005);稀釋液(沖洗液):pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號(hào)1105312);以上培養(yǎng)基、稀釋液均由北京三藥科技開發(fā)公司生產(chǎn)。

1.3 器材 HTY-2000A集菌儀;PY-330型號(hào)一次性使用集菌培養(yǎng)器(批號(hào)20110924);可拆卸式集菌儀培養(yǎng)器以上器材均由杭州泰林醫(yī)療器械有限公司提供。

1.4 驗(yàn)證用微生物及其菌號(hào) 枯草芽胞桿菌CMCC(B)63501，金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003大腸埃希菌CMCC(B)44102，白色念珠菌CMCC(F)98001，黑曲霉CMCC(F)98003，銅綠假單胞菌CMCC(B)10104

2 菌液制備［1］

2.1 取經(jīng)30～35℃培養(yǎng)18～24 h，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽胞桿菌的肉湯培養(yǎng)物1 ml加9 ml鹽水(0.9%無菌氯化鈉溶液)，10倍稀釋至10-7，細(xì)菌數(shù)約為10～100CFU/ml，做活菌計(jì)數(shù)備用。

2.2 經(jīng)20～25℃培養(yǎng)24～48 h的白色念珠菌改良馬丁液體培養(yǎng)物1 ml加9 ml鹽水(0.9%無菌氯化鈉溶液)，10倍稀釋至10-7，細(xì)菌數(shù)約為10～100CFU/ml，做活菌計(jì)數(shù)備用。

2.3 取經(jīng)20～25℃培養(yǎng)5～7 d的黑曲霉改良馬丁瓊脂培養(yǎng)物，加3～5 ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液將孢子洗脫，再用無菌毛細(xì)吸管吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液將菌懸液稀釋至每1 ml中含10～100CFU的孢子懸液，做活菌計(jì)數(shù)備用。采用中國藥典2010版提供的方法制備菌液，除黑曲霉菌液取10-5外，其余5種均取10-7的菌液。

3 方法及結(jié)果

中國藥典有關(guān)微生物限度檢查法方法驗(yàn)證試驗(yàn)［2］。

3.1 菌落計(jì)數(shù)(常規(guī)法)

3.1.1 供試液的制備 樣品10 ml，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，充分搖勻制成1:10的供試液。

3.1.2 試驗(yàn)組 薄膜過濾法，取兩只已滅菌的可拆卸集菌器，先泵入100 ml左右的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，再泵入20 ml上述供試液，混勻，過濾。用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，沖洗濾膜3次，每次100 ml，在最后一次淋洗液中分別接入1 ml已制備好的菌液，取出濾膜，菌面朝上貼于瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。重復(fù)上述操作，做完其余的試驗(yàn)菌。每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。

3.1.3 供試品對(duì)照組 驗(yàn)組的方法處理，不加菌液，菌面朝上貼于相應(yīng)的培養(yǎng)基培養(yǎng)。

3.1.4 菌液組 1 ml上述制備的菌液，直接接種于平皿，加入相應(yīng)的培養(yǎng)基培養(yǎng)。

3.1.5 稀釋劑對(duì)照組 直接以pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試品，其余試驗(yàn)操作同試驗(yàn)組。

3.2 培養(yǎng) 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)平皿倒置于30℃ ～35℃下培養(yǎng)3 d;將玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)平皿倒置于23℃ ～28℃下培養(yǎng)5 d。

3.3 觀察和計(jì)數(shù) 平皿逐日檢查計(jì)數(shù)，結(jié)果以培養(yǎng)終了時(shí)的計(jì)數(shù)方法為準(zhǔn)，并將每組試驗(yàn)中接有相同試驗(yàn)菌株的2個(gè)平皿計(jì)數(shù)進(jìn)行平均，取平均值。

表1 菌液組計(jì)數(shù)結(jié)果(CFU/ml)

表2 薄膜過濾法試驗(yàn)組回收率(%)

表3 薄膜過濾法稀釋劑對(duì)照組回收率(%)

供試品對(duì)照組的細(xì)菌總數(shù)和霉菌總數(shù)均＜1個(gè)/g，根據(jù)以上結(jié)果:在三次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，稀釋劑對(duì)照組的菌回收率和試驗(yàn)組的菌回收率均大于70%。

4 控制菌檢查法

4.1 供試液的制備 同菌落計(jì)數(shù)法。

4.2 試驗(yàn)組 采用薄膜過濾法，取兩只已滅菌的可拆卸集菌器，先泵入100 ml左右的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，再泵入20 ml上述供試液，混勻，過濾。用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，沖洗濾膜3次，每次100 ml，在最后一次淋洗液中加入已制備好的菌液(其中一管加入1 ml的大腸埃希菌菌液，另一管加入1 ml的銅綠假單胞菌菌液)。取出濾膜，分別放至100 ml的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中。同以上操作，在最后一次淋洗液中加入金黃色葡萄球菌菌液，取出濾膜，放至100 ml的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基。置30℃ ～35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h。

4.3 陰性對(duì)照組 方法同試驗(yàn)組，用金黃色葡萄球菌作為大腸埃希菌的陰性對(duì)照菌，用大腸埃希菌作為金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的陰性對(duì)照菌。置30℃ ～35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h。

4.4 結(jié)果 取接有大腸埃希菌的試驗(yàn)組及其陰性對(duì)照組的培養(yǎng)物0.2 ml，分別接種至5 mlMUG培養(yǎng)管內(nèi)，30℃ ～35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～24 h，取未接種的MUG培養(yǎng)管作本底對(duì)照，將各管置365nm紫外光燈下檢視，如有大腸埃希菌生長應(yīng)呈現(xiàn)熒光，然后加數(shù)滴靛基質(zhì)試液，結(jié)果見表4。

表4

取接有銅綠假單胞菌的試驗(yàn)組及其陰性對(duì)照組的培養(yǎng)物，劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基的平板上，30℃ ～35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h。結(jié)果:試驗(yàn)組菌落呈扁平、無定形、周邊擴(kuò)散、表面濕潤，灰白色，周圍時(shí)有藍(lán)綠色色素?cái)U(kuò)散。表示有典型的銅綠假單胞菌生長。陰性對(duì)照組沒有檢出銅綠假單胞菌。

取接有金黃色葡萄球菌的試驗(yàn)組及其陰性對(duì)照組的培養(yǎng)物，劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)24～72 h。結(jié)果:試驗(yàn)組菌落呈金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有黃色環(huán)，菌落直徑0.7～1 mm。表示有典型的金黃色葡萄球菌生長。陰性對(duì)照組沒有檢出金黃色葡萄球菌。

根據(jù)以上結(jié)果，本品控制菌檢查采用薄膜過濾法，培養(yǎng)基用量為100 ml。

5 小結(jié)

鹽酸阿撲嗎啡鼻噴劑的微生物限度檢查方法對(duì)微生物生長沒有抑制性影響。因此，此方法驗(yàn)證通過。

［1］ 蘇德模，馬緒榮.藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù).華齡出版社，2007:277-316.

［2］ 國家藥典委員會(huì).中國藥典.(二部).中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄 107-116.