靳志敏，段艷，通力嘎，賈雪暉，袁倩，靳燁

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特，010018)

隨著人們生活水平的提高，心血管疾病患病率和死亡率的逐年上升，已成為引起人類死亡的主要殺手。而血清中的膽固醇被認(rèn)為是誘發(fā)冠心病、動脈粥樣硬化等心血管疾病的主要危險因素［1］。國內(nèi)外均有大量研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌在體內(nèi)外具有降低膽固醇的益生功能，長期食用乳酸菌及其制品可降低血液中膽固醇含量，降低心血管病的發(fā)病率［2］。因此研究乳酸菌的降膽固醇性能及其生長特性，對于開發(fā)功能性發(fā)酵制品，豐富現(xiàn)有發(fā)酵制品的種類，提高發(fā)酵制品的附加值具有重要的現(xiàn)實意義。本文旨在對經(jīng)初步篩選得到的，膽固醇降解率達(dá)40%以上的乳酸菌在模擬肉湯培養(yǎng)基中的膽固醇降解率及其生長特性進(jìn)行進(jìn)一步研究，篩選高降解膽固醇能力及生長性能良好的菌株，為篩選1 株性能優(yōu)良的乳酸菌作為發(fā)酵香腸發(fā)酵劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院乳制品研究與培訓(xùn)中心保存，經(jīng)初步篩選得到的6 株降膽固醇性能優(yōu)良的乳酸菌［4］。

標(biāo)準(zhǔn)菌株:植物乳桿菌，廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心，a2m 1.191。

培養(yǎng)基:膽固醇篩選培養(yǎng)基;MRS 培養(yǎng)基;模擬肉湯培養(yǎng)基;MRS +6% NaCl +150 mg/kg NaNO2［3］培養(yǎng)基;

模擬肉湯-CHOL:模擬肉湯液體培養(yǎng)基中添加0.2%(W/V)牛膽鹽和0.2%巰基乙酸鈉，121℃滅菌15 min 后，添加2%的(1.0 g/100 mL)無菌膽固醇溶液。

膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液:精確稱量膽固醇50.0 mg，用無水乙醇定容于50 mL 的容量瓶中，配成1 mg/mL 的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液。精確吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的標(biāo)準(zhǔn)液于50 mL 容量瓶中，用無水乙醇定容，進(jìn)而得到10、20、30、40、50 μg/mL 的梯度溶液。

儀器設(shè)備:ZHJH-C1214C 超凈工作臺;南京依貝儀器設(shè)備有限公司;YXQ-LS-SⅡ立式壓力蒸氣滅菌鍋，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;T6 新世紀(jì)紫外可見分光光度計;北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 膽固醇降解率的測定

1.2.1.1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

精確吸取各梯度膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL 于試管中，在真空條件下抽干，然后準(zhǔn)確加入2.0 mL 鄰苯二甲醛溶液振蕩使之充分溶解，放置10 min 后加入1.0 mL 的濃H2SO4，混合均勻，室溫放置10 min 使之顯色，在550 nm 波長下測定吸光值(2.0 mL 鄰苯二甲醛溶液加入1.0 mL 的濃硫酸，室溫放置10 min 調(diào)零)。以O(shè)D550值為橫坐標(biāo)，膽固醇濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［4］。

1.2.1.2 樣品處理及菌株降膽固醇率的測定

將各菌株于液體MRS 培養(yǎng)基中活化3 代后按2%接種量接于模擬肉湯-CHOL 培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h 后于12 000 r/min 離心10 min 后，取上清液0.5 mL 用鄰苯二甲醛比色法測定其膽固醇含量［5－8］。實驗重復(fù)3 次取平均值。

1.2.2 菌株生長能力測定

1.2.2.1 不同pH 值生長能力的測定

將菌株于液體MRS 培養(yǎng)基中活化3 代后按2%接種量接種于pH 3.5，pH 4.5，pH 5.5，pH 9.6 液體MRS 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h 以不同pH 的MRS 為空白對照于600 nm 下測OD值［9］。實驗重復(fù)3 次取平均值。

1.2.2.2 菌株不同溫度生長能力測定

將菌株于液體MRS 培養(yǎng)基中活化3 代后按2%接種量接種于液體MRS 培養(yǎng)基中，分別于4，10，15，25，30，45℃培養(yǎng)24 h，以MRS 為空白對照于600 nm下測OD值［10，12］。實驗重復(fù)3 次取平均值。

1.2.3 菌株不同培養(yǎng)基中不同天數(shù)的產(chǎn)酸能力測定

將于液體MRS 培養(yǎng)基中活化3 代的菌株以2%接種量接種于液體MRS 培養(yǎng)基，模擬肉湯培養(yǎng)基，MRS+6% NaCl +150 mg/kg NaNO2培養(yǎng)基［3］中，分別于第1，2，4，6，8，10，13 天時測定其pH 值［3，11］。實驗重復(fù)3 次取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 各菌株對膽固醇降解率

2.1.1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

以O(shè)D550值為橫坐標(biāo)，膽固醇濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y= 349.66x－0.549，R2=0.9915。

2.1.2 膽固醇降解率

試驗菌株在添加0.2%(W/V)牛膽鹽和0.2%巰基乙酸鈉，2%的(1.0 g/100 mL)無菌膽固醇溶液培養(yǎng)基中的膽固醇降解率如表1 所示。

表1 不同菌株膽固醇降解率Table 1 Cholesterol-reducing ability of different strains

從表1 可以看出，經(jīng)過初步篩選好的，對于降膽固醇降解能力較好的6 株乳酸菌，其膽固醇降解能力與標(biāo)準(zhǔn)菌相比差異較大，其中只有TF3201 號菌株降解率低于標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)株，其它菌株膽固醇降解率遠(yuǎn)大于標(biāo)準(zhǔn)菌，其中2 －2B33、TE7401、TE5301、TF5201 號菌株降解率較好都達(dá)到70%以上。

2.2 菌株生長能力

2.2.1 不同pH 生長能力

乳酸菌在不同pH 條件下的生長能力見圖1。

圖1 不同pH 值下菌株的生長情況Fig.1 Growth ability in different pH of different strains

從圖1 可以看出，在pH 3.5 時2 －2B33 號菌株的生長能力較標(biāo)準(zhǔn)菌株差，在pH 4.5、pH 5.5 時除菌株2 －2B33，TF7401 外其余菌株生長能力都強于標(biāo)準(zhǔn)菌株，在pH 9.9 時各株菌生長性能都弱于標(biāo)準(zhǔn)菌。但六株乳酸菌對pH 值的適應(yīng)范圍都較廣，在太酸或太堿條件下其生長能力受到了一定影響，但各株菌在pH 4.5、pH 5.5 時生長能力都較好。

2.2.2 不同溫度生長能力

乳酸菌在不同溫度下的生長能力見圖2。

圖2 不同溫度下菌株生長能力Fig.2 Growth ability in different temperature of different strains

從圖2 可以看出，不同溫度對菌株的影響不同，6株乳酸菌的最適生長溫度都為30℃。菌株在不同溫度下的生長速度差異顯著，溫度從10℃上升至30℃的過程中，生長速度隨溫度的升高而加快;當(dāng)溫度繼續(xù)升高時，生長速度反而減慢。而在4℃，10℃時菌株的生長速度相近且生長能力都較弱。各菌株在低于25℃時其生長能力弱于標(biāo)準(zhǔn)菌，但在25℃、30℃時除2 －2B33 外其余菌株生長性能與標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)株相近且在45℃時菌株生長性能都優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)菌株。菌株的整體生長速度依次為:V30℃＞V25℃＞V45℃＞V15℃＞V10℃＞V4℃。

2.3 不同培養(yǎng)基中不同天數(shù)的產(chǎn)酸能力

2.3.1 MRS 培養(yǎng)基

乳酸菌在MRS 培養(yǎng)基中不同時間的產(chǎn)酸情況見表2。

表2 菌株在MRS 培養(yǎng)基中pH 值變化Table 2 Eventually pH of Strains in different days in media MRS

從表2 可知，不同菌株在MRS 培養(yǎng)基中的產(chǎn)酸能力稍有不同，6 株菌的產(chǎn)酸能力都較強但稍弱于標(biāo)準(zhǔn)菌株，各菌株培養(yǎng)1d 時pH 值就可降到4 以下，5 號菌株pH 值達(dá)到了3.88，同時TF5201，2 －2B33，TE7401 號菌株2 d 后的產(chǎn)酸性能較其他菌株稍好，F(xiàn)D4401、TF5201、TE5301 號菌株在10 天后其pH 值有所回升其原因還有待進(jìn)一步研究。

2.3.2 模擬肉湯培養(yǎng)基

乳酸菌在模擬肉湯培養(yǎng)基中不同天數(shù)的產(chǎn)酸情況見表3。

表3 菌株在模擬肉湯培養(yǎng)基中pH 值變化Table 3 Eventually pH of Strains in different days in media Meat Model

由表3 可以看出，不同菌株在模擬肉湯培養(yǎng)基中的產(chǎn)酸性能差異不大，培養(yǎng)1 d 時各株菌的pH 值可降到4.00 左右，2 d 后各株菌的pH 值達(dá)到最低且基本保持穩(wěn)定，各菌株在模擬肉湯中產(chǎn)酸性能稍弱于標(biāo)準(zhǔn)菌。

2.3.3 MRS+6% NaCl +150mg/kg NaNO2培養(yǎng)基

乳酸菌在MRS+6% NaCl +150mg/kg NaNO 培養(yǎng)基中不同天數(shù)的產(chǎn)酸情況見表4。

表4 菌株在MRS+6% NaCl+150mg/kg NaNO2 培養(yǎng)基中pH 值變化Table 4 Eventually pH of Strains in different days in media MRS+6% NaCl +150 mg/kg NaNO2

由表4 可知，不同菌株在MRS +6% NaCl +150 mg/kg NaNO2培養(yǎng)基中產(chǎn)酸性能差異不大，各株菌在1 天后pH 值已降到4.00 左右且產(chǎn)酸性能稍弱于標(biāo)準(zhǔn)菌，但2 d 后各菌株pH 值降到3.70 左右且保持穩(wěn)定，其中除2 －2B33 號菌株外，其余菌株產(chǎn)酸性能都稍強于標(biāo)準(zhǔn)菌。

3 結(jié)論

通過測定從內(nèi)蒙古傳統(tǒng)乳制品中分離的6 株降膽固醇性能優(yōu)良的乳酸菌對肉品中膽固醇降解作用及其生長特性，得菌株TE5201，2 － 2B33，TE7401，TE5301 的膽固醇降解率達(dá)70%以上，而標(biāo)準(zhǔn)菌膽固醇降解率為51.76%，TF3201 號菌株的降解率為41.39%且低于標(biāo)準(zhǔn)菌。在不同溫度、不同pH 條件下菌株FD4401，TE5201，TE3201，TE5301 生長性能都較好且都優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)菌，同時，各菌株經(jīng)過在不同培養(yǎng)基中13 天的培養(yǎng)，只有在MRS +6% NaCl +150 mg/kg NaNO2培養(yǎng)基中的產(chǎn)酸性能稍優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)菌株，其中菌株TE7401 在MRS、模擬肉湯、MRS+6% NaCl+150 mg/kg NaNO2培養(yǎng)基中13 d 內(nèi)產(chǎn)酸性能較好，尤其在MRS +6% NaCl +150 mg/kg NaNO2培養(yǎng)基中1 d 后的pH 值已降到3.98，2 d 后pH 值降到3.65且保持穩(wěn)定。發(fā)酵劑發(fā)酵性能較好這為肉制品發(fā)酵時快速產(chǎn)酸，提高產(chǎn)酸力，為有效抑制雜菌打下了良好的基礎(chǔ)。故TE7401 號菌可做為1 株降膽固醇性能、生長性能良好的肉制品發(fā)酵劑。

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