張瑞，邢軍，毛居代·亞爾買買提，朱思屹，古力依帕爾·于蘇普，布阿提開木·麥麥提沙吾提

1(新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊，8300541)

2(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊，8300462)3(四川省水產(chǎn)局檢測中心，四川 成都，610072)

紅莧菜(Amaranthus tricolorL. )為莧科屬植物，一年生草本，富含多種營養(yǎng)成分，是常見的夏季普通蔬菜，常呈紅色、紫色或綠紫雜色;其莖、葉色素含量較高，是一種良好的提取天然色素的原材料［1－2］。紅莧菜性味甘涼，清熱解毒，散瘀利膽，主治痢疾、黃疸、子宮癌等，有利于強(qiáng)身健體，提高機(jī)體的免疫力，有“長壽菜”之稱［3－4］。新疆各地普遍有栽培，供食用。

紅莧菜中所含的紅色素色澤鮮艷，無毒，安全性高，性質(zhì)穩(wěn)定，是天然的食用色素，其主要成分是花色苷色素，具有預(yù)防心血管疾病和某些癌癥、保護(hù)視力、抗氧化、抗衰老、抗?jié)?、抗炎等生理和藥用功能?－5］。近十幾年來，食品的安全性越來越引起人們的重視，盡管我國準(zhǔn)許使用合成色素莧菜紅并且對(duì)其使用量有嚴(yán)格的規(guī)定，但是人們還是認(rèn)為不如天然色素安全［5］。目前，合成色素莧菜紅廣泛用于食品、飲料、藥品、化妝品、飼料、煙草、玩具、食品包裝材料等的著色［5－6］。如果以天然莧菜紅色素取代合成色素，將有廣闊的市場前景。除此之外，由于紅莧菜作為一種藥食兩用植物，其分布廣且價(jià)格便宜，紅莧菜天然紅色素作為食品添加劑的開發(fā)和利用有著廣闊的發(fā)展前景。本文研究了紅莧菜天然紅色素的最佳提取工藝條件，并在前人研究的基礎(chǔ)上［2－3，7］，對(duì)紅莧菜紅色素穩(wěn)定性進(jìn)行了驗(yàn)證與補(bǔ)充研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅莧菜(2011 年8 月采自喀什疏附縣)，晾干，粉碎過40 目篩，黑暗條件下貯于干燥器中備用、大豆油(市售)。

HCl、NaOH、NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、AlCl3、FeCl3、CuCl2、抗壞血酸、H2O2、蔗糖、葡萄糖、無水酒精、醋酸鈉、醋酸，均為分析純(新疆烏魯木齊市托普化玻儀器有限公司)。

UV－2800 型紫外可見分光光度計(jì)(上海龍尼柯儀器有限公司);電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海-恒科儀器有限公司);電熱恒溫水浴鍋(HWS28)型(上海-恒科學(xué)儀器有限公司);電子天平(BS223S)型(北京多賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紅莧菜紅色素提取工藝研究

1.2.1.1 色素提取工藝流程［7－10］

1.2.1.2 紅莧菜紅色素光譜特性的研究

稱取0.50 g 原料，用體積分?jǐn)?shù)20%乙醇按固液比為1∶25(g∶mL)在40℃經(jīng)4h 提取。將提取液稀釋15 倍，用UV －2800/2802/2802S 型紫外可見分光光度計(jì)在室溫下于280 ～750 nm 內(nèi)掃描測定［9］。

1.2.1.3 浸提劑的選擇

分別稱取0.50 g 紅莧菜8 份，放入100 mL 三角瓶中，分別加入12.5 mL 的水、加入乙醇(%):10、20、30、40、50、60、70，在相同條件下浸提紅色素4 h，分別測定其吸光度。

1.2.1.4 浸提時(shí)間的選擇

分別稱取0.50 g 紅莧菜6 份，放入100 mL 三角瓶中，加入12.5 mL 的體積分?jǐn)?shù)40%的乙醇，在40℃的水浴條件下，浸提時(shí)間(h)為1、2、3、4、5、6，分別在相同條件下測定其吸光度。

1.2.1.5 浸提溫度對(duì)浸提效果的影響

分別稱取0.50g 紅莧菜5 份，放入100 mL 三角瓶中，加入12.5 mL 的體積分?jǐn)?shù)40%的乙醇，浸提溫度(℃)為20、30、40、50、60 的水浴中浸提4h，分別在相同條件下測定其吸光度。

1.2.1.6 固液比對(duì)浸提效果的影響

分別稱取0.50 g 紅莧菜5 份，放入100 mL 三角瓶中，加入固液比(g∶mL)分別為1∶10、1∶15、1∶20、1:25、1∶30 的40%的乙醇，在40℃的水浴中浸提2h，分別定容至30 mL，稀釋15 倍后測定其吸光度。

1.2.1.7 紅莧菜天然紅色素提取工藝的優(yōu)化設(shè)計(jì)［11－12］

在單因素考察基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法確定影響水平，根據(jù)Box-Benhnken 的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，固定浸提溶劑，采用3 因素3 水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確定紅莧菜天然紅色素提取的最佳條件。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1 The level of response surface experimental factors

1.2.1.8 pH 示差法測定紅莧菜中花色苷總量［13－14］

使用矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(HPLC98%)作為對(duì)照品，分別在pH1.0(緩沖體系為KCl-HCl)及pH4.5(緩沖體系為醋酸鈉-冰醋酸)時(shí)測定0.5 g 樣品的吸光度值，再運(yùn)用示差法計(jì)算溶液中總花色苷含量，分別取3 組數(shù)據(jù)取平均值，計(jì)算公式如下［13，14］:

式中:c為樣品中花色苷的濃度(mg/100 mL);A320pH1.0、A320pH4.5、A700pH1.0、A700pH4.5分別為樣液在pH 值1.0 和4.5 時(shí)，320、700 nm 處的最大吸光度;29 600 L/mol 為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù);449 為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的分子質(zhì)量;N代表樣液稀釋倍數(shù)。

1.2.2 不同環(huán)境條件下紅莧菜天然紅色素穩(wěn)定性研究［9－11］

1.2.2.1 pH 值對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

取紅莧菜色素提取液20 mL，溶解于200 mL 40%乙醇溶液中，用HCl、NaOH 配制pH 值為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0 的緩沖液，準(zhǔn)確移取10 mL 緩沖液于10 mL 紅莧菜色素乙醇溶液中，室溫暗處放置5 h，定時(shí)取樣，在320 nm 處測定吸光度，對(duì)比液為10 mL pH 緩沖液加10 mL 40%乙醇溶液。1.2.2.2 光線對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

移取3 份紅莧菜色素提取液各5 mL，用40%乙醇稀釋13 倍后，分別置于室內(nèi)避光、室內(nèi)散射光、日光下5 h，定時(shí)取樣，在320 nm 處測定吸光度。

1.2.2.3 溫度對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

移取5 份紅莧菜色素提取液各5 mL，用40%乙醇稀釋13 倍后，分別置于50、60、70、80、90℃的水浴中保溫5 h，定時(shí)取樣，冷卻到室溫后，在在320 nm 處測定吸光度。

1.2.2.4 常見金屬離子對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

分別配制濃度為0.1%的Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Al3+、Fe3+、Cu2+溶液，各取4 mL 加入16 mL 紅莧菜色素乙醇溶液中，室溫暗處放置5 h，在320 nm 處定時(shí)測定吸光度并觀察產(chǎn)生的現(xiàn)象。

1.2.2.5 氧化劑對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

選用H2O2作為氧化劑，配制0.1%、0.5%、1.0%的溶液，各吸2 mL 加入18 mL 紅莧菜色素乙醇溶液中，在室溫暗處放置5 h，在320 nm 處定時(shí)測定。

1.2.2.6 還原劑對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

選用抗壞血酸作為還原劑，配制0.1%、0.5%、1.0%的溶液，各吸2 mL 加入18 mL 紅莧菜色素乙醇溶液中，在室溫暗處放置5 h，在320 nm 處定時(shí)測定。

1.2.2.7 糖對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

分別配制濃度為2.5%、5.0%、10%的葡萄糖、蔗糖，取4 mL 加入16 mL 的紅莧菜色素乙醇溶液中，在室溫暗處放置5 h，在320 nm 處定時(shí)測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅莧菜紅色素提取工藝參數(shù)的確定

2.1.1 紅莧菜紅色素光譜特性

由圖1 可知，紅莧菜紅色素在320 nm 處有一個(gè)最大吸收峰，在530 nm 處有一個(gè)側(cè)峰，這是植物中花青素的特征吸收峰之一［12］。證明紅莧菜紅色素主要屬于花青素。本實(shí)驗(yàn)部分以該波長下測定的吸光度大小作為色素提取率多少的技術(shù)指標(biāo)。

圖1 不同波長下紅莧菜紅色素的吸光度Fig．1 Absorbance of red pigment from red amaranth under different wavelengths

2.1.2 浸提劑的確定

表2 不同浸提劑對(duì)紅莧菜紅色素的提取效果的比較Table 2 Comparison of extraction efficiency of different extractants on the red pigment

由表2 可以看出，40%乙醇浸提紅莧菜紅色素的效果最好，乙醇濃度越高，提取獲得的脂溶性色素如葉綠素逐漸增多，而紅色素逐漸減少。故選擇40%乙醇作為色素的浸提劑。

2.1.3 浸提時(shí)間對(duì)浸提效果的影響

圖2 浸提時(shí)間對(duì)浸提的影響Fig．2 The impact of time on the extraction

由圖2 可以看出，浸提浸提1 ～3 h，紅色素浸提率逐漸增大，浸提時(shí)間超過3 h 后，紅色素浸提率減小，因此可以得到結(jié)論，浸提時(shí)間應(yīng)控制為4 h 以內(nèi)為宜，最佳浸提時(shí)間為3 h。

2.1.4 浸提溫度對(duì)浸提效果的影響

由圖3 表明，隨著溫度的升高，溶劑的滲透力逐漸增強(qiáng)，有利于紅色素的溶出。溫度由20℃向40℃升高時(shí)，浸提率也在提高，40℃時(shí)浸提效果最好，而當(dāng)溫度高于40℃時(shí)，吸光度值有下降趨勢，原因可能是因?yàn)榧t莧菜紅色素對(duì)熱不夠穩(wěn)定。故最佳浸提溫度為40℃。

圖3 浸提溫度對(duì)浸提的影響Fig．3 The impact of temperature on the extraction

2.1.5 固液比對(duì)浸提效果的影響

由表3 可以看出，當(dāng)固液比為1∶10、1∶15 的時(shí)候，濾餅殘?jiān)腥詭в性S多紅色素。當(dāng)固液比為大于1∶20 時(shí)，濾餅殘?jiān)谢撅@示綠色了，紅色素殘留很少，固液比大于1∶30 時(shí)，復(fù)有少許紅色素沉積在濾餅上，因此固液比選擇1∶25 較為合適。

表3 不同固液比對(duì)浸提效果的比較Table 3 The impact of solid－liquid ratio on the extraction

2.1.6 響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)表4 數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA 分析，結(jié)果見表5。

采用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)紅莧菜紅色素提取條件進(jìn)行3 因素3 水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，運(yùn)用design expert 軟件對(duì)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析。以紅莧菜紅色素提取液的吸光值為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合后，確定函數(shù)表達(dá)式。試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表4 中心復(fù)合旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)的結(jié)果Table 4 Central composite design arrangement and experimental results

表5 回歸方程方差分析Table 5 Regression analysis of variance

該試驗(yàn)回歸方程為:

Y= 0.81 + 0.11A+ 0.044B+ 0.006 655C+0.064AB－0.003 75AC－0.004 682BC－0.046A2+0.026B2－0.039C2

該方程回歸顯著，模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方即R2=0.991 4，說明回歸方程的擬合程度良好，失擬較小，可以用該方程代替真實(shí)試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析。由表5中的P值可知，方程中A、B、AB、A2、B2、C2對(duì)吸光值對(duì)吸光值的影響達(dá)極顯著水平。表明試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系，二次項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值有很大的關(guān)系，這和模型回歸中的線性和平方項(xiàng)影響顯著項(xiàng)對(duì)應(yīng)。失擬項(xiàng)沒有顯著性影響，說明數(shù)據(jù)中沒有異常點(diǎn)，不需要引入更高次數(shù)的項(xiàng)，模型適當(dāng)。

2.1.7 響應(yīng)面直觀分析

由圖4 分析可知，響應(yīng)面的坡度很陡，可以得出浸提時(shí)間和浸提溫度的交互影響對(duì)莧菜紅色素的提取有顯著影響，通過等高線的疏密可以判斷在交互影響中浸提時(shí)間對(duì)響應(yīng)值的影響大于浸提溫度。

圖4 提取時(shí)間和浸提溫度對(duì)紅莧菜紅色素提取的響應(yīng)面分析Fig．4 Response surface analysis for effects of extraction time and temperature on the extracted red pigment from red amaranth

由圖5 分析可知，響應(yīng)面的坡度較陡，可以得出提取時(shí)間和固液比的交互影響對(duì)紅色素提取的影響不夠顯著。

圖5 提取時(shí)間和固液比對(duì)紅莧菜紅色素提取的響應(yīng)面分析Fig．5 Response surface analysis for effects of extraction time and ratio of solvent to material on the extracted red pigment from red amaranth

由圖6 分析可知，響應(yīng)面的坡度較陡，可以得出浸提溫度和固液比的交互影響對(duì)紅色素提取的影響不夠顯著。

通過軟件分析，得到紅莧菜紅色素的提取工藝最佳條件為浸提時(shí)間為3.91 h，浸提溫度為45℃，固液比為1∶26.18(g∶mL)。為檢驗(yàn)響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性，采用接近上述優(yōu)化提取條件浸提時(shí)間為4 h，浸提溫度為45℃，固液比為1∶25(g∶mL)進(jìn)行提取測定，實(shí)際測得紅莧菜紅色素提取液的吸光度平均值為0.965，與理論預(yù)測值0.985 相比，其相對(duì)誤差較小，因此，基于響應(yīng)面分析法所得的紅莧菜紅色素的提取條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

2.1.8 pH 示差法測定紅莧菜中花色苷總量( 表6)

2.2 不同環(huán)境條件下紅莧菜天然紅色素穩(wěn)定性

2.2.1 pH 值對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

從圖7 可以看出，紅莧菜紅色素在酸性pH 值條件下，相對(duì)穩(wěn)定，其吸光度變化不顯著，隨著時(shí)間的延長顏色無明顯的變化始終呈紅色，吸光度也沒有明顯下降;但是在堿性條件下，當(dāng)pH≥11 條件下很不穩(wěn)定，吸光度明顯下降，而且顏色也有明顯的變化，呈橙黃色，隨著時(shí)間的延長吸光度有下降的趨勢，顏色變淺［7］。

圖6 浸提溫度和固液比對(duì)紅莧菜紅色素提取的響應(yīng)面分析Fig．6 Response surface analysis for effects of extraction temperature and ration of solvent to material on the extracted red pigment from red amaranth

表6 pH 示差法測定紅莧菜中總花色苷含量Table 6 Total anthocyanins in red amaranth determined by pH-differential method

圖7 紅莧菜紅色素在不同pH 值條件下的吸光度值變化情況Fig．7 Absorbance value of red pigment from red amaranth changes under different pH

2.2.2 光對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

從圖8 可以看出，紅莧菜紅色素在室內(nèi)避光條件下?lián)p失很少，而且短期內(nèi)其吸光度值還有少量增加，這可能與溶劑的揮發(fā)有關(guān);在室內(nèi)散射光條件下?lián)p失較小;但在日光下不穩(wěn)定，吸光度下降相對(duì)明顯，但目測顏色變化不明顯［7，9］。所以紅莧菜紅色素在使用和保存時(shí)應(yīng)該避光處理，宜放棕色瓶內(nèi)。

2.2.3 溫度對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

圖8 紅莧菜紅色素在不同光條件下的吸光度值變化情況Fig．8 Absorbance value of red pigment from red amaranthchanges under different light conditions

從圖9 可以看出，紅莧菜紅色素在溫度為50 ～60℃時(shí)吸光度變化較小，顏色無顯著變化，說明損失不大;當(dāng)溫度大于70℃時(shí)，其損失較大，顏色有明顯的變化［7，10］。在70 ～90℃的溫度下，紅莧菜紅色素的損失主要發(fā)生在1 ～3 h，顏色由原來的紅色變成橙黃色，在3 h 之后色素?fù)p失率趨于平緩，顏色逐漸變淡，所以在應(yīng)用時(shí)應(yīng)注意避免長時(shí)間處于70℃以上的高溫。

2.2.4 常見金屬離子對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

從圖10 可以看出，1 價(jià)金屬離子Na+和K+對(duì)紅莧菜紅色素的影響最?。?］，2 價(jià)離子Mg2+、Ca2+、Cu2+次之，3 價(jià)金屬離子(Al3+、Fe3+)對(duì)紅莧菜紅色素的影響較大，其中Fe3+的影響最大，金屬離子對(duì)紅莧菜紅色素的影響主要發(fā)生在0 ～2 h 之內(nèi)，2 h之后影響趨于平緩。從實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象上看，加入Al3+溶液后，色素色澤逐漸變淺，2 h 后開始出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象;而加入Fe3+溶液后，色素液迅速變色，呈黃色且有渾濁現(xiàn)象。

圖9 紅莧菜紅色素在不同溫度下的吸光度值變化情況Fig．9 Absorbance value of red pigment from red amaranth changes under different temperature conditions

圖10 紅莧菜紅色素在常見金屬離子存在條件下的吸光度值變化情況Fig．10 Absorbance value of red pigment from red amaranth changes under common metal ions existing conditions

圖11 紅色素在H2O2 存在下的吸光度值變化情況Fig．11 Absorbance value of red pigment from red amaranth changes under H2O2 existing conditions

圖12 紅色素在(抗壞血酸)存在下的吸光度值變化情況Fig．12 Absorbance value of red pigment from red amaranth changes under Ascorbic acid existing conditions

圖13 紅色素在不同濃度蔗糖溶液中的吸光度值變化情況Fig．13 Absorbance value of red pigment changes under different concentration of sucrose solution

2.2.5 常見氧化劑H2O2及還原劑( 抗壞血酸) 對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

圖14 紅色素在不同濃度葡萄糖溶液中的吸光度值變化情況Fig．14 Absorbance value of red pigment changes under different concentration of glucose solution

從圖12 可以看出，紅莧菜紅色素溶液中存在不同濃度的氧化劑(H2O2)或還原劑時(shí)，其吸光度有明顯的變化且隨時(shí)間延長而逐漸下降［7］，但變化幅度不同，氧化劑或還原劑溶液濃度越高，吸光度下降幅度越大，而且色素液逐漸褪色?？偟膩碇v，紅莧菜紅色素對(duì)氧化劑及還原劑較敏感，穩(wěn)定性較差。

2.2.7 糖對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

從圖10 和圖11 可以看出，紅莧菜紅色素在不同濃度的糖溶液中具有較好的穩(wěn)定性，在蔗糖溶液中，其吸光度下降主要發(fā)生在0 ～3 h，之后則又回升，隨時(shí)間的延長，有恢復(fù)至原水平的趨勢。在葡萄糖溶液中，吸光度下降主要發(fā)生在0 ～2 h，隨時(shí)間的延長則緩慢回升。5 h 之后，該色素在不同濃度的糖溶液中的吸光度基本恢復(fù)至原來的水平，由此可知糖類對(duì)紅莧菜紅色素具有一定的保護(hù)作用［7］。

3 結(jié)論

(1)紅莧菜紅色素主要屬于花青素，響應(yīng)面法Box-Benhnken 的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果表明，浸提時(shí)間、浸提溫度以及兩者之間的交互作用對(duì)紅莧菜紅色素的浸提影響極顯著，這一點(diǎn)在紅莧菜紅色素穩(wěn)定性試驗(yàn)中也得到了驗(yàn)證。最優(yōu)的浸提工藝條件是浸提時(shí)間為4h，浸提溫度為45℃，固液比為1∶25(g∶mL)。通過pH 示差法測定獲得紅莧菜中總花色苷含量約為3.534 mg/100 mL。

(2)紅莧菜紅色素在pH≤11 條件下比較穩(wěn)定，而在pH≥12 條件下不穩(wěn)定。在日光下較不穩(wěn)定，所以在使用和保存時(shí)應(yīng)該避光處理，最好放在棕色瓶內(nèi)。對(duì)高溫比較敏感，宜于低溫保存與處理使用。對(duì)Na+、K+、Mg2+、Ca2+比較穩(wěn)定，對(duì)Al3+、Fe3+、Cu2+不穩(wěn)定，所以儲(chǔ)存時(shí)避免使用鋁器、鐵器和銅器。對(duì)氧化劑較敏感，穩(wěn)定性較差，對(duì)還原劑不太敏感，穩(wěn)定性較好。受蔗糖、葡萄糖的影響很小，具有良好的穩(wěn)定性，因此可以在使用中應(yīng)用糖來保護(hù)紅莧菜紅色素。

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