·論 著·

乳鼠原代心肌細(xì)胞提取方法的改良

劉 威1，張光明2，袁 瑞1，萬曉明1，金 宏1*(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院臨床技能實(shí)驗(yàn)室，吉林 吉林 132013;2.北華大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，吉林 吉林 132001)

目的改進(jìn)傳統(tǒng)的SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法，探索更簡便、高效的心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法。方法用兩種不同方法提取心肌細(xì)胞，比較兩種不同提取方法對細(xì)胞存活率、搏動能力的影響。結(jié)果與傳統(tǒng)法相比用改良法提取的心肌細(xì)胞存活率較高，起搏較早，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.01)。結(jié)論用改良法提取心肌細(xì)胞，可獲得存活率高、純度高心肌細(xì)胞。且操作簡便，重復(fù)性好，是一種較為理想的提取原代心肌細(xì)胞的方法，可建立滿意的體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞模型。

乳鼠；心肌細(xì)胞；原代培養(yǎng)

1960年Harry首次成功提取出心肌細(xì)胞[1]。體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞模型能保持心肌特點(diǎn)并排除神經(jīng)和體液因素的影響，使細(xì)胞處于均一的環(huán)境[2]，易于控制環(huán)境條件，具有簡便、準(zhǔn)確、易于重復(fù)等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)驗(yàn)研究中廣泛被應(yīng)用。因心肌細(xì)胞對酶消化極為敏感，對消化力度的把握尤顯重要。消化過度可使心肌細(xì)胞損傷；消化不充分，細(xì)胞聚集成團(tuán)，貼壁后伸展不良，層疊生長，中心區(qū)密度過大致死亡，因此消化分離心肌細(xì)胞的方法對實(shí)驗(yàn)的成功至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)對傳統(tǒng)提取方法加以改良，提高細(xì)胞收獲率、細(xì)胞活力，為建立滿意的體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞模型提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物

新生72 h內(nèi)的SD大鼠乳鼠若干只，雌雄不限，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2主要儀器及試劑

DMEM培養(yǎng)基(Sigma公司)，磷酸鹽緩沖溶液(Sigma公司)，新生牛血清(杭州四季青公司)，胰蛋白酶(Sigma公司)，CO2培養(yǎng)箱(美國shell公司)，超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠)，Motic攝像倒置顯微鏡，高速離心機(jī)(北京京力離心機(jī)公司)，恒溫磁力攪拌器(江蘇金壇康華電子儀器廠)。

1.3心肌細(xì)胞的分離及培養(yǎng)

取新生72 h內(nèi)的SD大鼠8只，碘伏浸泡消毒后酒精擦洗2～3遍消毒，剪出心臟，立即放入盛有預(yù)冷含雙抗的PBS溶液中，剪開心臟沖洗3次，修剪完畢后在大離心管內(nèi)剪碎，將組織碎塊平均分為兩部分，置于兩個大離心管中待消化。

1.3.1傳統(tǒng)法

在上述一支裝有組織塊的大離心管內(nèi)加入0.25%的胰蛋白酶5 mL左右，并加入一枚轉(zhuǎn)子，置于恒溫磁力攪拌器上37 ℃水浴中，調(diào)整轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速為100 r/min，使組織塊與酶液充分接觸，消化7 min，沉淀后將上清液吸出，從第2次消化開始收集，加入含血清的培養(yǎng)液終止消化。重復(fù)上述步驟直至組織塊消化完畢。

1.3.1改良法

對另一只大離心管中的組織塊進(jìn)行消化。首次同上法，棄上清。從第2次消化開始注意根據(jù)組織塊的顏色，分散程度等情況，判斷組織塊被消化的程度，通過實(shí)時調(diào)整0.25%胰蛋白酶和PBS的比例調(diào)整消化力度，最大限度的保證細(xì)胞的完整性和分散性。在消化的前2～4次時，組織塊色較紅，分散度好，可將0.25%胰蛋白酶與PBS按2∶1，或3∶2比例加入，消化5～6 min，轉(zhuǎn)子速度120 r/min。消化的第4～6次可調(diào)整0.25%胰蛋白酶與PBS比例為2∶3或1∶2，同時延長消化時間，降低轉(zhuǎn)速，減少對細(xì)胞的機(jī)械和化學(xué)損傷。消化后期，可將0.25%胰蛋白酶與PBS比例調(diào)整為1∶2或1∶3，進(jìn)一步將低轉(zhuǎn)速，保護(hù)細(xì)胞的完整。每次消化結(jié)束后收集消化液，及時加入小牛血清以終止消化。

對兩種方法收集到的消化液，分別以200目的濾網(wǎng)過濾，1 000 r/min離心10 min，去上清，重懸后接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，培養(yǎng)箱中孵育90～120 min后吸出細(xì)胞懸液，離心，將沉淀重懸按105～106個/mL的密度接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4觀察項(xiàng)目及檢測指標(biāo)

1.4.1光鏡檢查

鏡下觀察兩種方法提取的心肌細(xì)胞的生長情況，如細(xì)胞形狀、是否貼壁、伸展程度、何時起搏、計(jì)數(shù)心肌細(xì)胞每分鐘搏動的次數(shù)、及起搏細(xì)胞的數(shù)量。心肌細(xì)胞的可搏動性是其區(qū)別于其他細(xì)胞的重要標(biāo)志，是否搏動可直接反映心肌細(xì)胞的生長狀態(tài)。對兩種方法消化下來的心肌細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，鏡下任選5個視野計(jì)數(shù)有搏動的心肌細(xì)胞數(shù)量和，重復(fù)實(shí)驗(yàn)6次，來比較不同消化方法對細(xì)胞起搏能力的影響。

1.4.2細(xì)胞存活率的計(jì)算

用臺盼藍(lán)染液對不同消化方法獲得的細(xì)胞進(jìn)行染色，鏡下觀察，計(jì)數(shù)4大格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)及活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1心肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

由于機(jī)械力和胰蛋白酶的共同作用，心肌細(xì)胞剛分離出來呈球形，懸浮與培養(yǎng)液中。傳統(tǒng)法瓶內(nèi)有少量細(xì)胞碎片和部分有少量細(xì)胞形成的細(xì)胞團(tuán)；改良法瓶內(nèi)罕有細(xì)胞碎片，細(xì)胞完整性好，分散度好(圖1)。8～12 h后細(xì)胞開始貼壁生長，并逐漸伸出偽足伸展呈梭形、三角形、不規(guī)則形(圖2)。改良法瓶內(nèi)18～24 h后細(xì)胞絕大多數(shù)貼壁，且部分細(xì)胞出現(xiàn)自發(fā)性搏動，節(jié)律不規(guī)則，為30～70次/min。其中單個細(xì)胞貼壁較好，傳統(tǒng)法瓶內(nèi)細(xì)胞團(tuán)貼壁生長較慢，伸展差(圖3)。48～72 h細(xì)胞伸出偽足相互連接形成細(xì)胞層，產(chǎn)生同步性較好的搏動，頻率為90～130次/min(圖4)。培養(yǎng)48 h后有搏動的心肌細(xì)胞數(shù)量傳統(tǒng)法為55.5±3.18個，改良法為76.5±2.07個，兩者有顯著性差異(P<0.01)。這與改良法在消化過程中對心肌細(xì)胞的刺激較小，有利于細(xì)胞恢復(fù)搏動有關(guān)。

A：傳統(tǒng)法 B：改良法圖 1 剛提取出來的心肌細(xì)胞(×40)

2.2不同消化方法對心肌細(xì)胞存活率的影響

細(xì)胞存活率計(jì)數(shù)結(jié)果為：傳統(tǒng)法83.47±2.05個，改良法95.79±1.44個 。對兩種方法消化的大鼠心肌細(xì)胞存活率進(jìn)行配對t檢驗(yàn)，結(jié)果表明有顯著性差異(P<0.01)，說明用改良法消化心肌細(xì)胞，對心肌細(xì)胞破壞較輕，存活率較高。

圖 2 改良法培養(yǎng)8～12 h后的心肌細(xì)胞(×40)

A：傳統(tǒng)法 B：改良法圖 3 培養(yǎng)18～24 h的心肌細(xì)胞(×40)

A：傳統(tǒng)法 B：改良法圖 4 培養(yǎng)48～72 h的心肌細(xì)胞(×40)

3 討 論

傳統(tǒng)的乳鼠心肌細(xì)胞提取方法[3]近年來在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)有一些不足，如分離心肌細(xì)胞時收獲率不夠理想。因此一些改進(jìn)方法應(yīng)運(yùn)而生，主要是采用幾種消化酶合用，如Boerma法等[4-5]。但不同消化酶的作用時間和消化強(qiáng)度不同，不易確定共同消化時間，先消化下來的心肌細(xì)胞就會始終浸泡在消化液中，長時間在消化液的作用下，這些心肌細(xì)胞就有可能活力下降或死亡。因此兩者一起對細(xì)胞進(jìn)行消化時易造成消化不徹底或消化過度，導(dǎo)致大量細(xì)胞團(tuán)形成或細(xì)胞破裂，細(xì)胞喪失貼壁能力和/或收縮現(xiàn)象，直接影響細(xì)胞生長狀態(tài)。也有文獻(xiàn)報道[6-8]利用不同類型的膠原蛋白酶(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型)以不同濃度與胰蛋白酶混合消化心肌細(xì)胞，但過程較復(fù)雜，成本昂貴。另有報道用單一的胰蛋白酶進(jìn)行消化，每次消化的濃度和時間固定，但消化不夠理想，細(xì)胞收獲率不穩(wěn)定[9-11]。本研究對傳統(tǒng)的胰蛋白酶濃度和時間不變的消化法進(jìn)行了改進(jìn)，根據(jù)組織塊的具體消化程度，及時調(diào)整消化力度，包括胰蛋白酶的濃度、消化時間、轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)速等條件，最大限度的保證細(xì)胞的完整度和分散度，且操作簡便，成本較低。

同時本研究通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)得出一些經(jīng)驗(yàn)，可提高培養(yǎng)的成功率。在選擇新生乳鼠時應(yīng)盡量選擇鼠齡短的乳鼠，鼠齡越短，心肌細(xì)胞活力越好。一般選擇出生72 h內(nèi)的乳鼠，以24 h內(nèi)為佳。細(xì)胞培養(yǎng)中污染是一個常見問題。為防止污染在對乳鼠消毒時要嚴(yán)格徹底；剪開胸廓時要避免剪開腹腔；在操作過程中要遵守?zé)o菌操作原則，也可在培養(yǎng)液中加入雙抗防止細(xì)菌污染。另外，為最大限度的保持細(xì)胞的完整性，對總的消化時間應(yīng)加以控制，一般將其控制在2 h以內(nèi)，時間長會導(dǎo)致先消化下來的心肌細(xì)胞活力下降甚至破碎。同時接種心肌細(xì)胞時應(yīng)注意調(diào)整細(xì)胞密度，細(xì)胞數(shù)過少，不利于心肌細(xì)胞的快速生長和起搏。在對換液時間的把握上，應(yīng)每日觀察培養(yǎng)液的外觀，換液應(yīng)視其顏色變化、渾濁程度等情況而定，一般48～72 h換液即可。換液過早、過頻會刺激細(xì)胞，影響細(xì)胞生長，并加大污染機(jī)會；但長期不換液使?fàn)I養(yǎng)消耗殆盡，細(xì)胞搏動能力下降，狀態(tài)差，并發(fā)生轉(zhuǎn)化。

總之,本研究改良了現(xiàn)存的心肌細(xì)胞提取方法，成功建立了活力好的培養(yǎng)心肌細(xì)胞模型，能滿足藥理、毒理等大多數(shù)實(shí)驗(yàn)研究的需求。

[1] Harary L,Farley B.Invitro studies of single isolated beating heart cells[J].Science,1960,131(3414):1674-1675.

[2] 徐叔云,卞如鐮,陳 修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:1056-1057.

[3] Simpson P,Savion S.Simpaon P.Differentiation of rat myocytes in single cell cultures with and without proliferating nonmyocardial cells.Cross-striations,ultrastructure,and chronotropic response to isoproterenol[J] .Circ Res,1982,50(1):101-116.

[4] Boerma M,van der Wees C G,Wondergem J,et al.Separation of neonatal rat ventricular myocytes and non-myocytes by centrifugal elutriation[J] .Pflugers Arch,2002,444(3):452-456.

[5] 沈 靜,謝苗榮,徐 雍,等.乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)及純化方法的改良[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)刊,2001,3(3):225-226.

[6] Bartoli M,Claycomb W C.Transfer of macromolecules into living adult cardiomyocytes by microinjection[J].Mol Cell Biochem,1997,172(1/2):103-109.

[7] Yonemochi H,Yasunaga S,Teshima Y,et al.Mechanism of beta-adrenergic receptor upregulation induced by ACE inhibition in cultured neonatal rat cardiac myocytes:roles of bradykinin and protein kinase C[J].Circulation,1998,97(22):2268-2273.

[8] Clark W A,Decker M L,Behnke-Barclay M,et al.Cell contact as an independent factor modulating cardiac myocyte hypertrophy and survival in long-term primary culture[J].J Mol Cell Cardiol,1998,30(1):139-155.

[9] Dosenko V E,Nagibin V S,Tumanovskaya L V,et al.Postconditioning prevents apoptotic necrotic and autophagic cardiomyocyte cell death in culture[J].Fiziol Zh,2005,51(3):12-17.

[10] Miki N,Hamamori Y,Hirata K,et al.Transforming growth factor-beta 1 potentiated alpha 1-adrenergic and stretch-induced c-fos mRNA expression in rat myocardial cells[J].Circ Res,1994,75(1):8-14.

[11] Weisensee D,Seeger T,Bittner A,et al.Cocultures of fetal and adult cardiomyocytes yield rhythmically beating rod shaped heart cells from adult rats[J].In Vitro Cell Dev Biol Anim,1995,31(3):190-195.

Improvementsofmethodsofprimaryculturingmyocardialcellsofneonatalrat

LIU Wei1，ZHANG Guang-ming2,YUAN Rui1，WAN Xiao-ming1，JIN Hong1*

(1.Laboratory of Clinical Skill，Jilin Medical College，Jilin City,Jilin Province,132013；2.Department of Urinary Surgery，the Affilated Hospital of Beihua University,Jilin city,Jilin Province,132001,China)

ObjectiveTo improve the existing culture method used for the myocardial cell culture of neonatal rats and explore a more convenient and efficient method to culture myocardial cells.MethodsTwo different methods were used to digest the myocardial cells，then compared through their influence on the cell survival rate and beating capacity.ResultsThere were significant differences (P﹤0.01) in the myocardial survival rates between the different groups,because the rate with the modified method was higher than that with the traditional method.ConclusionBy using the modified method,more intact and pure myocardial cells could be obtained by timely adjusting trypsin concentration,the digestion time and the rotor speed.It is satisfied for the culture of myocardial cells model.

neonatal rat;cell culture;myocardial cells

R-332

A

2013-09-21)

1673-2995(2013)06-0435-04

吉林省教育廳項(xiàng)目(2011281,2012330,2012329).

劉 威(1976-)，女(漢)，助理實(shí)驗(yàn)師，碩士.

金 宏(1977-)，女(漢族)，副教授,碩士.