許曉巖 楊媛華 翟振國 龐寶森 王 辰

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院北京呼吸疾病研究所，北京100020;3.衛(wèi)生部北京醫(yī)院北京呼吸疾病研究所，北京100730)

肺血栓栓塞癥(pulmonary thromboembolism，PTE)和下肢深靜脈血栓形成(deep venous thrombosis，DVT)是靜脈血栓癥(venous thromboembolism，VTE)的2個不同階段。目前認(rèn)為VTE是由于遺傳和(或)環(huán)境異常造成的一種多基因、多因素疾病。其中凝血系統(tǒng)基因多態(tài)性是研究方向之一。凝血因子ⅩⅢ，簡稱因子ⅩⅢ(FⅩⅢ)基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)與疾病關(guān)系的研究［1-5］顯示，A 亞基 Val34Leu(100G/T)多態(tài)性中突變等位基因T可能對心腦血管疾病和VTE具有保護作用，但我國對此的研究資料有限。關(guān)于B亞基His95Arg(8259A/G)多態(tài)性的資料不多，有研究［6］顯示其突變等位基因 G可能與 A亞基Val34Leu多態(tài)性中的T等位基因有協(xié)同作用，顯著降低心肌梗死的危險，但據(jù)報道［7］，此突變會增加DVT的風(fēng)險，未見其與PTE關(guān)系的報道，中國人中更未見該多態(tài)性的研究。本研究利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)－限制性片段長度多態(tài)性(restricted fragment length polymorphisms，RFLP)技術(shù)，在中國漢族人群中對FⅩⅢ A亞基 Val34Leu和 B亞基His95Arg多態(tài)性與PTE的關(guān)系進行探討。

1 資料與方法

1.1 研究對象

采用病例－對照研究。病例組來自2002年6月到2007年2月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院呼吸科確診的PTE患者114例。所有病例均按照中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會制定的《肺血栓栓塞癥的診斷與治療指南(草案)》［8］的標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)核素肺通氣/灌注掃描(V/Q)高度可能和/或螺旋CT肺動脈造影(computed tomography pulmonary angiography，CTPA)見血栓直接征象確診PTE。對照組為與PTE患者1∶1配對的114例健康對照。對照組與PTE患者同為漢族，性別相同，年齡近似(±2歲)，既往無DVT、PTE病史，與PTE患者無血緣關(guān)系，無心、腦、肺、腎、血液、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病。主要來自門診體檢者和健康志愿者。對研究對象遵守醫(yī)學(xué)倫理學(xué)的一般原則。

1.2 實驗方法

1)標(biāo)本采集:采空腹靜脈血4 mL，EDTA抗凝。

2)DNA制備:采用低滲溶血法從新鮮全血中分離白細(xì)胞。采用酚－氯仿－異戊醇法提取DNA，用滅菌純水調(diào)整DNA濃度在0.1 μg/μL左右，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3)FⅩⅢ A亞基 Val34Leu基因多態(tài)性:采用PCR-RFLP聯(lián)合聚丙烯胺凝膠電泳(PAGE)檢測FⅩⅢ A亞基Val34Leu多態(tài)性。

參照文獻［9］的引物。引物1:5'-CATGCCTTTTCTGTTGTCTTC-3';引物 2:5'-TACCTTGCAGGTTGACGCCCCGGGGCACTA-3'，其中引物2將3'端第二個堿基由胞嘧啶(C)換成了胸腺嘧啶(T)，從而引入了一個限制性內(nèi)切酶DdeⅠ的酶切位點。在基因文庫(GenBank)中進行核對并尋找相應(yīng)序列。在eppendorf梯度核酸擴增儀進行熱循環(huán)。25 μL PCR反應(yīng)體系:樣品DNA(0.1 μg/ μL)1.0 μL，dNTP 混合物(各 2.5 mmol/L)2.0 μL，引物(50 mmol/L)各 0.2 μL，Ex Taq DNA 聚合酶(大連寶生物工程公司，5U/ μL)0.2 μL，10×反應(yīng)緩沖液(含Mg2+)2.5 μL，滅菌雙蒸水 18.9 μL。PCR 反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃ 2 min;變性95℃ 30 s，復(fù)性58℃45 s，延伸72℃ 30 s，循環(huán)35次;后延伸:72℃ 5 min。2%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。

取 PCR 擴增產(chǎn)物 8 μL，限制性內(nèi)切酶 DdeⅠ1 μL(紐英倫生物技術(shù)有限公司，10U)，緩沖液1 μL，制成混合物，37℃水浴4 h。12%PAGE，分析酶切產(chǎn)物。

4)FⅩⅢ B亞基 His95Arg基因多態(tài)性:采用PCR-RFLP聯(lián)合瓊脂糖凝膠電泳檢測FⅩⅢ B亞基His95Arg多態(tài)性。

參照Reiner等［6］設(shè)計的引物。引物1:5'-AAAGACAAGCTTAGTTTCATCATT-3';引物2:5'-TCTTCAGTTTAGGAAATGATTCTTAT-3'。在基因文庫(GenBank)中進行核對并尋找相應(yīng)序列。在eppendorf梯度核酸擴增儀進行熱循環(huán)。25 μL PCR反應(yīng)體系:樣品DNA(0.1 μg/ μL)1.0 μL，dNTP 混合物(各 2.5 mmol/L)2.0 μL，引物(50 mmol/L)各 0.2 μL，Ex Taq DNA 聚合酶(大連寶生物工程公司，5U/ μL)0.2 μL，10×反應(yīng)緩沖液(含Mg2+)2.5 μL，滅菌雙蒸水 18.9 μL。PCR 反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃ 2 min;變性95℃ 30 s，復(fù)性58℃30 s，延伸72℃ 30 s，循環(huán)35次;后延伸:72℃ 5 min。2%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。

取 PCR 擴增產(chǎn)物 8 μL，限制性內(nèi)切酶 NsiⅠ1 μL(紐英倫生物技術(shù)有限公司，10U)，緩沖液1 μL，制成混合物，37℃水浴4 h。2% 瓊脂糖凝膠電泳分析酶切產(chǎn)物。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件建立數(shù)據(jù)庫并進行數(shù)據(jù)整理與分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，計數(shù)資料以構(gòu)成比或率表示。基因頻率采用基因計數(shù)法計算，基因型分布是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律及兩組間等位基因頻率的差異比較采用χ2檢驗;兩組間計算比數(shù)比(OR)和95%的可信區(qū)間(CI)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTE組和對照組的基本情況

PTE組和對照組各114例，其中每組男性70例，女性44例。2組平均年齡均為55歲(表1)。

表1 PTE組和對照組基本情況比較Tab.1 The age and sex of PTE patients and 114 healthy controls

2.2 FⅩⅢ基因多態(tài)性的PCR產(chǎn)物及酶切結(jié)果分析

1)FⅩⅢA亞基Val34Leu多態(tài)性:PCR擴增出1條含F(xiàn)ⅩⅢ A亞基Val34Leu多態(tài)性位點的DNA片段，長192 bp(圖1)。經(jīng)限制性內(nèi)切酶DdeⅠ酶切后，野生型(GG)沒有酶切位點，不被切割，仍為192bp 1個片段;雜合型(GT)呈192bp、161bp和31bp 3個片段;未見突變型(TT)。由于31bp片段短，不易觀察，故主要區(qū)分192bp和161bp 2個片段(圖2)。

2)FⅩⅢB亞基His95Arg多態(tài)性:PCR擴增出1條含F(xiàn)ⅩⅢB亞基His95Arg多態(tài)性位點的DNA片段，長264bp(圖3)。經(jīng)限制性內(nèi)切酶NsiⅠ酶切后，野生型(AA)呈129bp和135bp 2個片段;雜合型(AG)呈264bp、129bp和135bp 3個片段;未見突變型(GG)。由于129 bp和135bp 2個片段僅相差6個bp，2%的瓊脂糖凝膠電泳不能區(qū)分，僅呈1條條帶(圖4)。

圖1 PCR擴增出一條含F(xiàn)ⅩⅢA亞基Val34Leu多態(tài)性位點的DNA片段，長192 bpFig.1 The polymerase chain reaction(PCR)was used to amplify a 192-bp fragment from the factorⅩⅢA subunit gene

圖4 經(jīng)限制性內(nèi)切酶NsiⅠ酶切后Fig.4 The PCR product was digested with Nsi I

2.3 PTE組和對照組間FⅩⅢ基因多態(tài)性比較

1)FⅩⅢA亞基Val34Leu多態(tài)性:PTE組和對照組均未檢測到突變純合子(TT)，并且 GG和 GT基因型在2組中分布相同，GG型113(99.1%)，GT型1(0.9%)，等位基因G和T的頻率分別0.996，0.004(表2)?；蛐头植季螲ardy-Weinberg平衡。

2)FⅩⅢ B亞基His95Arg多態(tài)性:PTE組，F(xiàn)ⅩⅢB亞基His95Arg多態(tài)性AA、AG、GG基因型的分布頻數(shù)分別為111(97.4%)、3(2.6%)、0(0);等位基因A和G的頻率分別0.987，0.013。對照組 AA、AG、GG基因型的分布頻數(shù)分別為104(91.2%)、10(8.8%)、0(0)。等位基因A和G的頻率分別0.956，0.044。對2組不同基因型實際頻數(shù)和期望頻數(shù)分別做χ2檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，基因型分布均符合 Hardy-Weinberg平衡。2組均未檢測到突變純合子(GG)。2組間基因型的分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.997，P=0.046)。2組間等位基因的分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.880，P=0.049)，PTE 組 G 等位基因分布顯著低于對照組(表3)。相對于AA基因型而言，AG基因型有減低 PTE發(fā)生危險的趨勢(OR=0.281，P=0.046)。

表2 FⅩⅢA亞基Val34Leu多態(tài)性基因型頻率和等位基因頻率Tab.2 FⅩⅢ A Val34Leu(100G/T)polymorphisms n(%)

表3 FⅩⅢB亞基His95Arg多態(tài)性基因型頻率和等位基因頻率Tab.3 FⅩⅢ B His95Arg(8259A/G)polymorphisms n(%)

3 討論

凝血因子ⅩⅢ，簡稱因子ⅩⅢ(FⅩⅢ)是機體凝血瀑布反應(yīng)的最后一個酶，又稱纖維蛋白穩(wěn)定因子。血漿中的FⅩⅢ 以酶原形式存在，呈四聚體結(jié)構(gòu)(A2B2)，即2個A亞基和2個B亞基組成，其中A亞基具有轉(zhuǎn)谷氨酸酶活性，B亞基起載體作用。血漿中的FⅩⅢ活化為FⅩⅢa需要2步，第1步為凝血酶裂解A亞基精氨酸(Arg)37－甘氨酸(Gly)38鍵;第2步為B亞基從A亞基分離，使A亞基的半胱氨酸活性位點暴露。

FⅩⅢ A亞基 Val34Leu(100G/T)多態(tài)性與FⅩⅢB亞基His95Arg(8259A/G)多態(tài)性位于編碼區(qū)，造成了氨基酸的置換，可能影響了FⅩⅢ 的活化，進一步影響纖維蛋白凝塊的結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性［10］。

FⅩⅢ A亞基 Val34Leu(100G/T)多態(tài)性是指F13A基因的2號外顯子發(fā)生G→T的點突變，使34號密碼子所編碼的氨基酸由纈氨酸變?yōu)榱涟彼?Val34Leu)。這一多態(tài)性位點距凝血酶對FⅩⅢ 的活化部位僅3個氨基酸。現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)這一突變不影響FⅩⅢ的血漿水平，但使凝血酶對FⅩⅢ 的活化速度，在34Leu明顯快于野生型34Val，使纖維蛋白較快發(fā)生交聯(lián)，從而使血小板黏附下降，終止凝血過程，導(dǎo)致纖維蛋白凝塊結(jié)構(gòu)改變，穩(wěn)定性下降［11-15］。關(guān)于FⅩⅢA亞基Val34Leu多態(tài)性與VTE的關(guān)系國外有多篇報道。但對于T等位基因是否對VTE有保護作用，所得出的結(jié)論不一。2項Meta分析研究［4-5］中關(guān)于該多態(tài)性位點與VTE關(guān)系的研究，認(rèn)為T等位基因?qū)TE起保護作用。另外，文獻［16］報道FⅩⅢA亞基Val34Leu多態(tài)性存在明顯的種族差異。這一多態(tài)性在美洲印第安人最高(51.2%)，西方白色人種次之(44.3%)，黑色人種也較常見(28.9%)，而在日本人中最低(2.5%)。

我們的研究僅在PTE組和對照組中各檢測到1例FⅩⅢA亞基Val34Leu突變雜合子，即GT基因型，2組中基因型分布及等位基因頻率相同。T等位基因在中國漢族人群中少見，基因頻率為0.004，與以往的研究［17］相符。說明FⅩⅢ A亞基Val34Leu多態(tài)性可能對中國漢族人群PTE的發(fā)生影響很小;也進一步體現(xiàn)了基因多態(tài)性的地區(qū)和種族差異。說明盡管生活環(huán)境、習(xí)慣及其他因素在疾病的發(fā)生過程中起著重要作用，但不同種族在遺傳背景上的差異也是導(dǎo)致疾病易感性不同以及臨床表現(xiàn)不盡相同的一個重要因素。

FⅩⅢB亞基His95Arg(8259A/G)多態(tài)性是指F13B基因8259位點A→G突變，該突變位于3號外顯子上，導(dǎo)致FⅩⅢB亞基95位組氨酸(His)被精氨酸(Arg)替代。3號外顯子編碼FⅩⅢ B亞基的第2個Sushi域，該域參與 A、B亞基的結(jié)合。Komanasin等［7］在 Leeds(214 例患者－116 例 DVT、98 例 PTE，247例對照)和LETS(471例DVT，472例對照)兩項病例對照研究中探討FⅩⅢ B亞基His95Arg多態(tài)性與VTE的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)突變雜合子AG增加VTE的危險，OR值(95%CI)分別為1.6(1.0～2.6)和1.4(1.0～2.0)。Reiner等［6］一項關(guān)于女性心肌梗死(MI)發(fā)生危險性的研究，未發(fā)現(xiàn)FⅩⅢ B亞基His95Arg多態(tài)性與MI相關(guān)，但G等位基因與FⅩⅢA亞基Val34Leu多態(tài)性中的T等位基因有協(xié)同作用，在T等位基因攜帶者中，G等位基因顯著降低MI的危險，并能降低雌激素替代治療者發(fā)生MI的危險。

本研究首次在中國漢族人群中探討FⅩⅢB亞基His95Arg多態(tài)性，PTE組和對照組均未發(fā)現(xiàn)突變純合子(GG)。對照組 AA、AG基因型分別為 104(91.2%)、10(8.8%)，PTE 組 AA、AG 基因型分別為111(97.4%)、3(2.6%)，AG基因型在PTE組檢出較少(P=0.046)，相對于AA基因型而言，AG基因型有減低PTE發(fā)生危險的趨勢(OR=0.281)，但95%CI在0.075～1.050，進一步增大樣本量，有望得到陽性結(jié)果。這與Komanasin等［7］得出的結(jié)論不符，考慮可能與疾病類型及人種、地區(qū)不同有關(guān)。對于FⅩⅢ B亞基His95Arg多態(tài)性的研究資料有限，有待更多的研究闡述其與血栓性疾病的關(guān)系。

中國漢族人群中，F(xiàn)ⅩⅢ A亞基Val34Leu(100C/T)多態(tài)性少見，該多態(tài)性可能對中國漢族人群PTE的發(fā)生影響很小。中國人群中存在FⅩⅢ B亞基His95Arg(8259A/G)多態(tài)性。健康對照組中AA、AG、GG 3種基因型的分布為104(91.2%)、10(8.8%)、0(0)，G等位基因的頻率為0.044?；蛐头植季螲ardy-Weinberg平衡。突變雜合子AG基因型有減低PTE發(fā)生危險的趨勢。

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