張 婷 王曉民

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系，北京100069)

《Science》2012年度十大科學(xué)突破:

1)希格斯玻色子的發(fā)現(xiàn)

2)古人類DNA序列的完美呈現(xiàn)

3)基因組的巡航導(dǎo)彈

4)中微子“第三種震蕩”

5)超越基因的基因組

6)“好奇號(hào)”的火星著陸系統(tǒng)

7)X射線激光器測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

8)腦機(jī)接口的成功應(yīng)用

9)馬約拉納費(fèi)米子確實(shí)存在

10)干細(xì)胞誘導(dǎo)成為卵細(xì)胞

生命科學(xué)領(lǐng)域中的突破:

1 古人類DNA序列的完美呈現(xiàn)［1］

目前，人們探索古人類的主要手段是通過(guò)各種化石等遺物。近年來(lái)，古遺傳學(xué)家對(duì)尼安德特人及丹尼索瓦人基因組全序列的揭示為該領(lǐng)域研究帶來(lái)了新的方式［2］。然而，與目前廣泛應(yīng)用的活組織DNA測(cè)序相比，古人類DNA測(cè)序結(jié)果還不夠精確，因?yàn)榇蟛糠謴幕刑崛〉腄NA已降解成單鏈，自動(dòng)測(cè)序儀無(wú)法識(shí)別。今年，德國(guó)馬普進(jìn)化人類學(xué)研究所的博士后Meyer建立了一種新型擴(kuò)增單鏈DNA的技術(shù)，并帶領(lǐng)其研究小組對(duì)丹尼索瓦人基因組重新測(cè)序，其結(jié)果與當(dāng)今活組織DNA測(cè)序結(jié)果的精確度非常接近。

Meyer建立的單鏈DNA文庫(kù)制備方法為(圖1):①將古人類DNA去磷酸化，加熱變性;②與生物素標(biāo)記的寡核苷酸接頭相連接，通過(guò)streptavidin包被的磁珠后，標(biāo)記的DNA被吸附下來(lái);③加入與寡核苷酸接頭互補(bǔ)的引物;④通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制單鏈DNA;⑤新合成的DNA單鏈與另一個(gè)雙鏈接頭的一條鏈連接;⑥加熱磁珠，釋放DNA。這一方法避免了DNA純化步驟，減少了樣本的消耗［3］。

通過(guò)此技術(shù)對(duì)居住在西伯利亞丹尼索瓦人洞穴中的女孩進(jìn)行研究，只需要6毫克小拇指指骨樣本，一次至少能拷貝99.9%的基因組，同時(shí)對(duì)其中92%的基因組可重復(fù)拷貝20次(這是確定核苷酸位置可靠性的指標(biāo))［3］。這是研究者第一次應(yīng)用基因組信息對(duì)古人類進(jìn)行研究。此研究的意義在于，丹尼索瓦人化石迄今僅存一小塊指骨和兩顆磨牙，卻得到了完整的DNA序列，而尼安德特人盡管已有上百塊化石，但基因組序列卻并不完整。該方法將進(jìn)一步應(yīng)用在更多化石標(biāo)本上，尼安德特人基因組序列有望在2013年得到完整揭示。

圖1 單鏈DNA文庫(kù)制備方法［3］

2 基因組的巡航導(dǎo)彈［1］

幾年前，成功的進(jìn)行基因敲入或敲除還是偶然現(xiàn)象，而且，人們也無(wú)法控制外源基因在宿主基因組中的插入位置，或者基因敲除實(shí)驗(yàn)中敲除的是哪個(gè)DNA。這種情況下，明確某一特定基因的作用或者糾正某個(gè)患病基因就非常困難。今年，研究人員得到了一些DNA修飾的有利工具，其中之一，被稱為轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶(transcription activator– like effectors nucleases，TALENs)。正如巡航導(dǎo)彈擊中軍事目標(biāo)一樣，TALEN可特異識(shí)別DNA序列并進(jìn)行切割，從而進(jìn)行基因修飾或敲除［4］。

2009年，《Science》同時(shí)發(fā)表兩篇文章，報(bào)道在植物病原菌黃單胞菌(Xanthomonas)上發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子(transcription activator– like effectors，TALEs)可特異性地結(jié)合到DNA上，在該病原菌感染過(guò)程中對(duì)植物基因進(jìn)行調(diào)控［5-6］。TALE蛋白的DNA結(jié)合域由一串連續(xù)排列、數(shù)目不同(12～30個(gè)不等)、序列高度同源的蛋白結(jié)構(gòu)域模塊構(gòu)成，每個(gè)模塊大小為33～35個(gè)氨基酸。模塊的第12位和13位的氨基酸，對(duì)應(yīng)識(shí)別DNA分子中四個(gè)堿基中的一個(gè)(圖2)。TALEN是由TALEs DNA結(jié)合域和核酸內(nèi)切酶FokⅠ的切割域融合而成。其中，TALEs的DNA結(jié)合域能夠識(shí)別特異的DNA序列，F(xiàn)okⅠ可通過(guò)二聚體產(chǎn)生核酸內(nèi)切酶活性，在特異的靶DNA序列上切斷雙鏈［7］。

圖2 TALE識(shí)別特異DNA序列［4］

發(fā)現(xiàn)TALEN時(shí)間非常短暫，卻已在各種模型中證實(shí)有效。Jaenisch等［8］在人胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ES)及誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞(pluripotent stem cell，iPS)中的五個(gè)不同的基因位點(diǎn)應(yīng)用TALEN，此前這五個(gè)基因位點(diǎn)曾使用鋅指核酸酶(zinc-finger nucleases，ZFNs)研究過(guò)，結(jié)果證實(shí)TALEN在位點(diǎn)特異性DNA修飾方面與ZFN具有相似的準(zhǔn)確性和有效性;Carlson［9］及同事應(yīng)用TALEN建立了小型豬單等位基因或雙等位基因敲除低密度脂蛋白受體基因的家族性高膽固醇血癥疾病模型;Ekker等［10］在斑馬魚中應(yīng)用TALEN進(jìn)行基因修飾的同時(shí)，引入了一個(gè)定制的EcoRⅤ位點(diǎn)和一個(gè)修飾的loxP(mloxP)位點(diǎn)，后者可條件性開(kāi)啟或關(guān)閉基因，用于觀察該基因在發(fā)育過(guò)程中的作用;Zhao等［11］應(yīng)用TALEN在人源細(xì)胞上對(duì)鐮刀型紅細(xì)胞貧血癥相關(guān)基因進(jìn)行糾正，證實(shí)了TALEN可用于基因治療。

基因編輯(gene editing)是研究生物學(xué)過(guò)程的有利手段。基因編輯的工具目前主要包括核酸內(nèi)切酶(endonucleases)，ZFNs和 TALENs［12］。其中，ZFN 的效果最引人注目，并已進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)。但其局限性是制備困難，而且關(guān)鍵技術(shù)均被一家公司申請(qǐng)了專利。而TALEN與ZFN相比同樣有效，但制備更加簡(jiǎn)單便宜。目前，一些研究者甚至認(rèn)為TALENs會(huì)成為所有分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的必備工具。

3 超越基因的基因組［1］

人類基因組計(jì)劃(HGP)研究已測(cè)定出人類基因組DNA的30億個(gè)堿基對(duì)序列，其中編碼蛋白的堿基對(duì)只有2%或更少。繼HGP之后又一大型國(guó)際合作項(xiàng)目“DNA元件百科全書”(the Encyclopedia of DNA Elements，ENCODE)對(duì)各基因之間的DNA序列進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)這些一度被認(rèn)為“荒漠”的基因組序列發(fā)揮了非常重要的作用，可開(kāi)啟或關(guān)閉基因表達(dá)。ENCODE計(jì)劃旨在完成HGP遺留的任務(wù)，為潛藏在“荒漠”中的功能性DNA序列編制目錄。

2003年，ENCODE開(kāi)展前期調(diào)研，對(duì)基因組中1%的部分進(jìn)行深入研究。結(jié)果提示，只有少數(shù)DNA被轉(zhuǎn)錄翻譯成蛋白，許多基因組被“轉(zhuǎn)錄”成非編碼的RNA分子。該發(fā)現(xiàn)公布不久后，ENCODE開(kāi)展了全面研究(圖3)，對(duì)至少147種細(xì)胞類型進(jìn)行了1 648項(xiàng)實(shí)驗(yàn)［13］。通過(guò)這些實(shí)驗(yàn)，研究者精確定位了每個(gè)基因的起始位點(diǎn)、終止位點(diǎn)及編碼區(qū)，發(fā)現(xiàn)有一些DNA編碼RNA后并不翻譯成蛋白，這些RNA存在于不同的細(xì)胞器［14］。因此，有人認(rèn)為基因組或遺傳學(xué)的最基本單位不是基因，而是DNA編碼的RNA。

圖3 ENCODE對(duì)DNA功能的全面研究［13］

其中一項(xiàng)對(duì)DNA的功能性研究評(píng)價(jià)了其在不同物種之間，以及同一物種不同個(gè)體之間的保守性。研究顯示在人類和哺乳動(dòng)物之間并不保守的序列在人群不同個(gè)體之間呈現(xiàn)保守性，如與神經(jīng)生長(zhǎng)及視錐細(xì)胞發(fā)育基因相鄰的區(qū)域，于是構(gòu)成了人類獨(dú)有的特征性表現(xiàn);同時(shí)，在人類和哺乳動(dòng)物之間保守的序列在人群中卻有差異，提示這些區(qū)域可能不再具有功能［15］。

另外一項(xiàng)研究是針對(duì)發(fā)揮基因調(diào)控功能的DNA序列，它們通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子或其他蛋白結(jié)合而發(fā)揮作用。其中，DNase-seq和 FAIRE-seq研究提示，42%的基因組可結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子或蛋白，而這些區(qū)域可能與不同疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)［16］。另外，該研究組［17］還發(fā)現(xiàn)此研究可預(yù)測(cè)參與疾病發(fā)病的細(xì)胞類型，例如，有兩種類型的T細(xì)胞參與了克羅恩病的發(fā)病。另外，ChIP-seq研究還對(duì)組蛋白與DNA的結(jié)合進(jìn)行了揭示［18］。另一項(xiàng)5C的技術(shù)對(duì)一個(gè)染色體上距離較遠(yuǎn)的DNA，甚至是不同染色體上的DNA相互作用進(jìn)行了研究［19］。

4 X射線激光器測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)［1］

X射線晶體衍射法(X-ray diffraction)是目前測(cè)定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的最主要和最精確的方法。X射線射至蛋白質(zhì)晶體上，可產(chǎn)生不同方向的衍射，X線片則接受衍射光束，形成衍射圖。然后借助計(jì)算機(jī)繪制出三維空間的電子密度圖。該方法要求首先將蛋白質(zhì)制備成晶體，但一些膜蛋白無(wú)法形成晶體。今年，研究人員用一種比傳統(tǒng)的同步加速輻射源亮10億倍的X射線激光測(cè)定了一種蛋白結(jié)構(gòu)(圖4)，有可能對(duì)傳統(tǒng)X射線無(wú)法測(cè)定的蛋白質(zhì)進(jìn)行解碼［20］。

圖4 X射線激光解密蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)［20］

非洲昏睡病每年要奪走3萬(wàn)人的生命。該疾病由單細(xì)胞寄生蟲布氏錐蟲引起，半胱氨酸蛋白酶組織蛋白酶 B(TbCatB)是其存活的關(guān)鍵酶。Chapman等［20］在細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)該酶，得到毫米水平的晶體。應(yīng)用X射線激光器，研究人員測(cè)定了TbCatB的無(wú)活性前體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其活性區(qū)域覆蓋著一種分子安全帽—前肽—而使其失活。該發(fā)現(xiàn)將有助于人們找到與這種前肽結(jié)構(gòu)相似的分子，從而抑制TbCatB的活性，殺死布氏錐蟲。

今年年初，日本研究人員也開(kāi)啟了X射線激光器研究。歐洲研究人員正在構(gòu)建此研究項(xiàng)目，估計(jì)2015年可以開(kāi)啟。這一應(yīng)用的宏偉目標(biāo)是將X射線衍射推向極限，通過(guò)X射線激光器解密蛋白結(jié)構(gòu)。

5 腦機(jī)接口的成功應(yīng)用［1］

Collinger等［20］報(bào)道，一位由于遺傳性神經(jīng)退變導(dǎo)致頸部以下癱瘓的53歲女性患者，學(xué)會(huì)了用思想控制機(jī)械臂，完成一系列日?；顒?dòng)。

研究者將兩個(gè)4×4毫米的96通道微電極植入患者大腦采集信號(hào)，植入?yún)^(qū)域?yàn)閰⑴c手部運(yùn)動(dòng)計(jì)劃的腦區(qū)。電腦將這些信號(hào)轉(zhuǎn)換成機(jī)械臂的運(yùn)動(dòng)指令，使該機(jī)械臂具備與人手臂運(yùn)動(dòng)相同的能力(圖5)。本研究持續(xù)了13周，研究者對(duì)患者進(jìn)行訓(xùn)練，目標(biāo)是能控制假肢進(jìn)行7個(gè)自由度的活動(dòng)，包括三維轉(zhuǎn)譯，三維定向以及一維抓取。患者控制假肢的能力通過(guò)上肢功能評(píng)分來(lái)判斷。通過(guò)這一系統(tǒng)，患者能夠控制機(jī)械臂完成一系列日?；顒?dòng)。訓(xùn)練進(jìn)行的第二天，患者就能夠在三維的空間內(nèi)控制機(jī)械臂。13周后，患者已經(jīng)可以常規(guī)完成七維的運(yùn)動(dòng)。任務(wù)型抓取的成功率為91.6%，完成時(shí)間不斷縮短(從最初的148秒降至112秒)?；颊吣軌蚩刂萍僦M(jìn)行技巧性和協(xié)調(diào)性的抓取和抓握運(yùn)動(dòng)，上肢功能評(píng)分有顯著的進(jìn)步，沒(méi)有不良反應(yīng)發(fā)生［21］。

圖5 癱瘓患者應(yīng)用腦機(jī)接口完成日常生活［23］

該研究呈現(xiàn)了癱瘓患者應(yīng)用腦機(jī)接口(brain-machine interface，BMI)能完成的最復(fù)雜運(yùn)動(dòng)。2012年5月，Hochberg等［21］報(bào)道了第一例癱瘓患者應(yīng)用BMI完成復(fù)雜的三維運(yùn)動(dòng)的研究。在此基礎(chǔ)上，本研究實(shí)現(xiàn)了更流暢更自然的運(yùn)動(dòng)。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)于癱瘓患者來(lái)說(shuō)是非常鼓舞人心的，然而真正的臨床應(yīng)用仍需要時(shí)間:機(jī)械臂仍處在試驗(yàn)階段，價(jià)格昂貴，其使用尚需技術(shù)人員的輔助;與未損傷肢體相比，BMI控制運(yùn)動(dòng)不夠迅速和流暢。當(dāng)然，這些可以通過(guò)變換算法模塊的改進(jìn)，使大腦信號(hào)解碼更準(zhǔn)確，對(duì)電腦及機(jī)械臂的指令更明確實(shí)現(xiàn)。這一技術(shù)為中風(fēng)、脊髓損傷或其他原因?qū)е碌陌c瘓患者帶來(lái)了新的希望。

6 干細(xì)胞誘導(dǎo)成為卵細(xì)胞［1］

2011年，日本京都研究組［24］報(bào)道了干細(xì)胞形成可繁殖精子的成果，2012年，該實(shí)驗(yàn)室［25］報(bào)道了形成卵子的類似過(guò)程。上述兩項(xiàng)研究所使用的干細(xì)胞都是胚胎干細(xì)胞(ES)和誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞(iPS)。從理論上講，兩者都能夠形成所有類型的體細(xì)胞，但大多數(shù)研究人員一直無(wú)法把它們變成生殖細(xì)胞，即精子和卵子的前體細(xì)胞。由干細(xì)胞生物學(xué)家Mitinori Saitou率領(lǐng)的研究小組找到了一個(gè)可行的方法。他們將ES和iPS細(xì)胞置于各種生長(zhǎng)因子及蛋白混合的“雞尾酒”中進(jìn)行孵育，將其誘導(dǎo)成為原生殖細(xì)胞(primordial germ cell，PGC)樣細(xì)胞。PGC為產(chǎn)生生殖細(xì)胞的早期細(xì)胞，既可分化為精原細(xì)胞，又可分化為卵原細(xì)胞［26］。為了得到卵母細(xì)胞，研究人員［25］隨后將這些PGC與胎鼠的卵巢細(xì)胞混合，并最終將其移植到活體小鼠的正常卵巢中。4周零4天后，PGC發(fā)育成為卵母細(xì)胞。研究人員去除卵巢，得到卵母細(xì)胞，并且對(duì)其進(jìn)行體外受精，然后再將得到的受精卵移植到雌鼠體內(nèi)。大約3周后，正常的小鼠誕生了(圖6)。

圖6 iPS細(xì)胞誘導(dǎo)成為卵細(xì)胞，體外受精后誕生正常小鼠［25］

這一發(fā)現(xiàn)對(duì)于研究生殖細(xì)胞成熟過(guò)程中的分子機(jī)制非常重要。同時(shí)，研究人員仍在進(jìn)一步探索完全體外誘導(dǎo)成熟卵細(xì)胞的方法，此方法將會(huì)對(duì)治療不孕不育癥提供新的途徑。如果干細(xì)胞能夠體外誘導(dǎo)成為生殖細(xì)胞，那么完全可以通過(guò)不育癥婦女的體細(xì)胞先誘導(dǎo)成為iPS細(xì)胞，再體外誘導(dǎo)iPS細(xì)胞形成卵細(xì)胞繼而體外受精。當(dāng)然，此過(guò)程中的技術(shù)難題以及倫理問(wèn)題仍有待解決。

致謝:感謝宮曉麗在本文撰寫過(guò)程中對(duì)參考資料的搜集。

［1］Breakthrough of the year.The runners-up［J］.Science，2012，338(6114):1525-1532.

［2］Green R E，Krause J，Briggs A W，et al.A draft sequence of the Neandertal genome［J］. Science，2010，328(5979):710-722.

［3］Meyer M，Kircher M，Gansauge M T，et al.A high-coverage genome sequence from an archaic Denisovan individual［J］.Science，2012，338(6104):222-226.

［4］Pennisi E.The tale of the TALEs［J］.Science，2012，338(6113):1408-1411.

［5］Boch J，Scholze H，Schornack S，et al.Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors［J］.Science，2009，326(5959):1509-1512.

［6］Moscou M J，Bogdanove A J.A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors［J］.Science，2009，326(5959):1501.

［7］Joung J K，Sander J D.TALENs:a widely applicable technology for targeted genome editing［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2012，14(1):49-55.

［8］Hockemeyer D，Wang H，Kiani S，et al.Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases［J］.Nat Biotechnol，2011，29(8):731-734.

［9］Carlson D F，Tan W，Lillico S G，et al.Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109(43):17382-17387.

［10］Bedell V M，Wang Y，Campbell J M，et al.In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system［J］.Nature，2012，491(7422):114-118.

［11］Sun N，Liang J，Abil Z，et al.Optimized TAL effector nucleases(TALENs)for use in treatment of sickle cell disease［J］.Mol Biosyst，2012，8(4):1255-1263.

［12］McMahon M A，Rahdar M，Porteus M.Gene editing:not just for translation anymore［J］.Nat Methods，2011，9(1):28-31.

［13］Pennisi E.Genomics.ENCODE project writes eulogy for junk DNA［J］.Science，2012，337(6099):1159，1161.

［14］Dunham I，Kundaje A，Aldred S F，et al.An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome［J］.Nature，2012，489(7414):57-74.

［15］Ward L D，Kellis M.Evidence of abundant purifying selection in humans for recently acquired regulatory functions［J］.Science，2012，337(6102):1675-1678.

［16］Pennisi E.The Biology of Genomes.Disease risk links to gene regulation［J］.Science，2011，332(6033):1031.

［17］Maurano M T，Humbert R，Rynes E，et al.Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA［J］. Science，2012，337(6099):1190-1195.

［18］Landt S G，Marinov G K，Kundaje A，et al.ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia［J］.Genome Res，2012，22(9):1813-1831.

［19］Sanyal A，Lajoie B R，Jain G，et al.The long-range interaction landscape of gene promoters［J］.Nature，2012，489(7414):109-113.

［20］Redecke L， Nass K， Deponte D P， et al. Natively Inhibited Trypanosoma brucei Cathepsin B Structure Determined by Using an X-ray Laser［J］.Science，2012，［Epub ahead of print］.

［21］Collinger J L，Wodlinger B，Downey J E，et al.High-performance neuroprosthetic control by an individual with tetraplegia［J］.Lancet，2012，［Epub ahead of print］.

［22］Hochberg L R，Bacher D，Jarosiewicz B，et al.Reach and grasp by people with tetraplegia using a neurally controlled robotic arm［J］.Nature，2012，485(7398):372-375.

［23］Courtine G，Micera S，Digiovanna J，et al.Brain-machine interface:closer to therapeutic reality［J］Lancet，2012，［Epub ahead of print］.

［24］Hayashi K，Ohta H，Kurimoto K，et al.Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells［J］.Cell，2011，146(4):519-532.

［25］Hayashi K，Ogushi S，Kurimoto K，et al.Offspring from oocytes derived from in vitro primordial germ cell-like cells in mice［J］.Science，2012，338(6109):971-975.

［26］Saitou M，Yamaji M.Primordial germ cells in mice［J］.Cold Spring Harb Perspect Biol，2012，4(11):a008375.