王 萍，李 莉，李 揚(yáng)，桓明輝，張 鵬

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院，遼寧 沈陽 110161;2.遼寧省微生物科學(xué)研究院，遼寧 朝陽 122000)

隨著社會的迅猛發(fā)展，生物農(nóng)藥因其符合環(huán)境保護(hù)、人類健康和食品安全的需要，已成為當(dāng)前化學(xué)殺菌劑的理想替代品，而獲得高效拮抗菌是生物防治的基礎(chǔ)，是實(shí)現(xiàn)全球提出的農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要發(fā)展目標(biāo)［1］。本研究所用死谷芽胞桿菌B10對多種食用菌病原菌如哈茨木霉(T.harzianum)、康氏木霉(T.koningii)、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、綠色木霉(Trichodermaviride)等都有明顯抑制作用，具有很好的應(yīng)用前景。本試驗(yàn)通過搖瓶發(fā)酵，對該菌產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)培養(yǎng)基及其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化篩選，得出其最適培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，為進(jìn)一步的生產(chǎn)工藝研究奠定基礎(chǔ)。對該菌的抑菌譜進(jìn)行了測試，證明其對多種食用菌病原真菌具有一定的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 拮抗菌死谷芽胞桿菌(B.vallismortis)B10由遼寧省微生物菌種選育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存。食用菌病原菌:木霉29(保藏中心編號3.3029)、棘孢木霉 30(Trichoderma asperellum)、康氏木霉(T.koningii)、深綠木霉 52(T.atroviride)、哈茨木霉 T22(T.harzianum)、哈茨木霉T2(T.harzianum)、長枝木霉(T.longibrachiatum)、綠色木霉(Trichodermaviride)、粗糙脈胞霉(Neurosporacrassa)、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)均由遼寧省微生物菌種保藏中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂 18 ～20 g，水 1000 mL，pH 自然;種子培養(yǎng)基:蛋白胨 10.0 g，NaCl 10.0 g，葡萄糖10.0 g，水 1000 mL，pH 7.0;斜面培養(yǎng)基:胰蛋白胨10.0 g，酵母浸膏10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂17.0～20.0 g，水 1000 mL，pH 7.0;發(fā)酵培養(yǎng)基:①ATCC 液體培養(yǎng)基:酵母膏 5.0 g，蛋白胨1.0 g，KH2PO41.0 g，NaCl 1.0 g，水950 mL，pH 6.8，121℃滅菌30 min后補(bǔ)加50 mL 10%葡萄糖(葡萄糖單獨(dú)用0.22 μm無菌濾器滅菌);②YPD液體培養(yǎng)基:酵母提取物 10.0 g，胰蛋白胨 20.0 g，葡萄糖 20.0 g，水 1000 mL，pH 7.0;③TYG 液體培養(yǎng)基:胰蛋白胨 3.0 g，酵母膏 3.0 g，葡萄糖 3.0 g，K2HPO41.0 g，水 1000 mL，pH 7.2;④BPY 液體培養(yǎng)基:牛肉膏 5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，酵母膏5.0 g，水 950 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌 30 min后補(bǔ)加50 mL 10%葡萄糖(葡萄糖單獨(dú)用0.22 μm無菌濾器滅菌);⑤NB液體培養(yǎng)基:牛肉浸膏 5.0 g，蛋白胨 10.0 g，NaCl 5.0 g，葡萄糖20.0 g，水 1000 mL，pH 7.0 ～7.2;⑥LB 液體培養(yǎng)基:胰蛋白胨 10.0 g，酵母膏 5.0 g，NaCl 10.0 g，水 1000 mL，pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1 最佳培養(yǎng)基的選擇 拮抗菌B10菌株最適液體培養(yǎng)基 ATCC、YPD、TYG、BPY、NB、LB 中篩選。pH 7.0，30 ℃，170 r/min，振蕩培養(yǎng) 36 h，測定抑菌圈直徑，確定菌株最佳培養(yǎng)基，每組試驗(yàn)3次重復(fù)。

1.2.2 無菌發(fā)酵液的制備 用無菌接種環(huán)挑取B10菌種一環(huán)，接種到含有50 mL種子培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，在30℃、170 r/min的恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)18 h，按4%接種量接種到100 mL/250 mL的NB液體培養(yǎng)基三角瓶中，30℃，170 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)36 h，8000 r/min離心20 min，上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，即為無菌發(fā)酵液［2］。

1.2.3 抑菌活性的測定［3］采用牛津杯擴(kuò)散法。將指示菌木霉29菌懸液加入40～50℃ PDA固體培養(yǎng)基中倒平板，待冷卻后，在PDA平板上同一直線相距3 cm處移入2個直徑為4 mm滅過菌的牛津杯，向牛津杯中加入150 μL B10發(fā)酵無菌濾液，對照牛津杯中加入無菌水，28℃培養(yǎng)3～5 d，觀察抑菌狀況和測量抑菌圈直徑。

1.2.4 生長曲線的測定 取1 mL培養(yǎng)好的種子液接種于裝有100 mL優(yōu)化培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件振蕩培養(yǎng)48 h，自接種后每3 h取樣1次測定菌液的OD600，用未接種培養(yǎng)基作為空白對照，重復(fù)3次［4］。

1.2.5 培養(yǎng)條件的優(yōu)化 以最佳培養(yǎng)基和篩選培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件為基礎(chǔ)，通過分別改變培養(yǎng)基的初始 pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)，接種量2%、4%、6%、8%和10%(體積比)、裝液量(250 mL 三角瓶每瓶裝50、75、100、125、150、175 mL)、培養(yǎng)溫度(25、30、32、35、37、40、45、50 ℃)、培養(yǎng)時間(12、24、36、48、60、72 h)和搖床轉(zhuǎn)速(130、150，170，190，210 r/min)，按 1.2.3 方法以抑菌圈直徑為指標(biāo)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，確定B10菌株最佳培養(yǎng)條件。

1.2.6 抗菌譜測定［5］在無菌條件下將融化的PDA培養(yǎng)基倒入滅好菌的平皿內(nèi)，冷卻后，在PDA平板上呈對角線移4個直徑為4 mm滅過菌的牛津杯，在平板中央接種4 mm病原菌菌餅，向牛津杯中加入150 μL B10發(fā)酵無菌濾液，28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，觀察抑菌情況和測量抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 B10菌株的生長曲線

如圖1所示，菌體在0～6 h的時間區(qū)間為菌種的生長延遲期，在這段時間，菌體得到復(fù)蘇和分散;9～18 h進(jìn)入對數(shù)生長期，菌體數(shù)量急劇增多;18～36 h菌體進(jìn)入生長的相對穩(wěn)定期，生長相對緩慢;從40 h以后，死谷芽胞桿菌進(jìn)入生長的衰亡期，活菌數(shù)減少。因此，菌株種齡為18 h，發(fā)酵周期為36 h。

圖1 B10菌株的生長曲線Fig.1 Growth cure of B10

2.2 最佳培養(yǎng)基的選擇

培養(yǎng)基是人們提供微生物生長繁殖及生物合成各種代謝產(chǎn)物所需要的按一定比例配制的多種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物［6］。圖2結(jié)果表明，不同培養(yǎng)基成分發(fā)酵培養(yǎng)對抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生影響很大。NB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的B10發(fā)酵液對指示菌的抑菌直徑達(dá)到19.1 mm，說明NB培養(yǎng)基更適合B10抗菌物質(zhì)的產(chǎn)生與分泌。

圖2 不同培養(yǎng)基對B10菌株發(fā)酵液拮抗活性的影響Fig.2 Effect of medium on antagonistic activity of fermentatiaon broth

2.3 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.3.1 初始pH值 由于搖瓶發(fā)酵過程中pH難以控制，因此只能控制發(fā)酵液的初始pH值，pH值主要通過影響菌體細(xì)胞膜電荷，引起膜滲透性變化以及改變營養(yǎng)物質(zhì)離子化程度，從而影響菌體對養(yǎng)分的吸收［7］。由圖3可知，B10菌株發(fā)酵液隨pH值增加呈先上升后下降趨勢，在pH值為7時，發(fā)酵液抑菌活性最大，抑菌直徑達(dá)到19.4 mm。

圖3 不同初始pH值對B10菌株發(fā)酵液拮抗活性的影響Fig.3 Effect of initial pH on antagonistic activity of fermentatiaon broth

2.3.2 裝液量 搖瓶中的通氧量直接影響菌株的生長和抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生，所以裝液量是影響微生物代謝產(chǎn)物生成的重要因素。如圖4所示，發(fā)酵液抑菌活性隨裝液量的增加呈先緩慢上升后快速下降趨勢，裝液量為100 mL/250 mL時，B10發(fā)酵液的抑菌直徑最大，達(dá)到21.5 mm。

圖4 不同裝液量對B10菌株發(fā)酵液拮抗活性的影響Fig.4 Effect of medium volume on antagonistic activity of fermentatiaon broth

2.3.3 培養(yǎng)溫度 溫度通過酶反應(yīng)速率、蛋白質(zhì)的合成和活性、DNA的結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)錄等影響微生物的生命活動［8］。由圖5可知，在溫度為30℃時，B10菌株發(fā)酵液抑菌活性達(dá)到最強(qiáng)，抑菌直徑為19.7 mm，適合抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生，繼續(xù)提高培養(yǎng)溫度，發(fā)酵液活性降低，所以最適溫度為30℃。

圖5 不同培養(yǎng)溫度對B10菌株發(fā)酵液拮抗活性的影響Fig.5 Effect of temperature on antagonistic activity of fermentatiaon broth

2.3.4 接種量 接種量的大小，影響菌體的生長濃度，同時影響菌體對發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的消耗，接種量太小延滯生長周期，而接種量太大會影響代謝產(chǎn)物的合成。如圖6所示，接種量為4%時，發(fā)酵液抑菌活性最強(qiáng)，但隨著接種量的增大活性不斷下降，故4%為B10發(fā)酵的最佳接種量。

圖6 不同接種量對B10菌株發(fā)酵液拮抗活性的影響Fig.6 Effect of inoculation quantity on antagonistic activity of fermentatiaon broth

2.3.5 搖瓶轉(zhuǎn)速 由圖7可知，隨著搖瓶轉(zhuǎn)速的提高，發(fā)酵液活性不斷增大，但高于170 r/min后，轉(zhuǎn)速提高活性下降。提高搖瓶轉(zhuǎn)速，可能會引起菌體自溶，對菌體產(chǎn)生機(jī)械損傷［9］。所以170 r/min為B10菌株發(fā)酵的最適搖瓶轉(zhuǎn)速。

圖7 不同搖瓶轉(zhuǎn)速對B10菌株發(fā)酵液拮抗活性的影響Fig.7 Effect of rotation speed on antagonistic activity of fermentatiaon broth

2.4 抑菌譜測定

死谷芽胞桿菌B10發(fā)酵液具有較廣的抑菌譜，對供測定的真菌病原菌抑制效果見表1及圖8，對木霉病原菌的抑菌效果顯著，抑菌率均達(dá)到60%以上，其中對哈茨木霉T22的抑菌率最高，達(dá)90.56%，木霉 29次之，抑菌率為 88.43%，對棘孢木霉30、深綠木霉52抑制效果較差。結(jié)果表明，死谷芽胞桿菌B10發(fā)酵液對供測定的幾種食用菌病原菌真菌都具有很好的拮抗作用，說明B10發(fā)酵產(chǎn)物在防治食用菌病原真菌方面的潛在應(yīng)用價值，具有開發(fā)生防產(chǎn)品潛能。

表1 死谷芽胞桿菌B10的抑菌作用Table 1 The inhibition effects of the strain of B10

3 討論

本試驗(yàn)通過搖瓶發(fā)酵對死谷芽胞桿菌B10產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行了初步研究，溫度、裝液量等因素都對B10產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)有明顯的影響，溫度過高或者過低都不利于菌株產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)，在接近中性環(huán)境中最易產(chǎn)生拮抗物質(zhì);接種種齡為18 h，此時的種子保持有旺盛的增殖能力和較高的菌體濃度以縮短發(fā)酵周期;發(fā)酵周期為36 h，B10菌株可充分分泌產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)，達(dá)到最佳抑菌效果［10］。死谷芽胞桿菌B10生長快，物理、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，通過分泌拮抗物質(zhì)和生長競爭，在防治病原真菌方面發(fā)揮多種有益作用［11］。B10菌株對多種食用菌病原真菌有很好的抑制作用，對哈茨木霉T22的抑菌率達(dá)到90%以上，是1株很有潛力的生防菌，有著不可低估的開發(fā)潛力，具有廣闊的應(yīng)用前景。

圖8 B10發(fā)酵液對病原菌的抑制作用Fig.8 The inhibitory effect of B10 on pathogenic fungi

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