邱昌恩，王衛(wèi)東

(湖北師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃石 435002)

QIU Chang-en，WANG Wei-dong

葛仙米(Nostoc sphaeroides Kützing)是因東晉煉丹術(shù)家、醫(yī)學(xué)家、道教理論家葛洪的名字而得名，古名天仙菜、天仙米、珍珠菜，俗稱水木耳［1］，學(xué)名稱擬球狀念珠藻。它是一種多細(xì)胞群體的淡水藻類，其主要形狀為球形，少數(shù)為紡錘形、橢圓形、啞鈴形或扁平狀，與地木耳(N.commune)、發(fā)菜(N.flagelliforme)同屬藍(lán)藻門(Cyanophyta)、藍(lán)藻綱(Cyanophyceae)、段殖藻目(Hormogonales)，念珠藻科(Nostocaceae)、念珠藻屬(Nostoc)［2］。發(fā)菜、地木耳及葛仙米均在原產(chǎn)地作為一種傳統(tǒng)食品食用。葛仙米絲狀體的外面有一共同的膠質(zhì)衣鞘，易形成層狀結(jié)構(gòu)，比較堅固［3］，呈墨綠色［4］。葛仙米在我國的主要分布地是湖北鶴峰縣走馬坪鎮(zhèn)，生于水稻田中［5-10］，為圓球狀群體。湖北的房縣［10］、陜西的靈丘、湖北的神農(nóng)架林區(qū)、廣西北流、廣東仁化［5］、江西井岡山［11］、安徽九華山［12］與潛山［13］、山東［14］、煙臺［15］等地有分布。葛仙米是一種具有自養(yǎng)固氮能力的微生物，其體內(nèi)含有固氮酶，可以同化其生長所需的氮素營養(yǎng)。其它異養(yǎng)菌類很難從葛仙米培養(yǎng)基獲得營養(yǎng)物質(zhì)，葛仙米能在幾乎無菌狀態(tài)下生長。目前人工培養(yǎng)葛仙米的培養(yǎng)基大多采用無氮的BG110培養(yǎng)基。本次研究通過外加不同氮濃度的NaNO3來培養(yǎng)葛仙米，通過測量葛仙米的葉綠素a含量的多少來研究外加氮源對葛仙米生長的影響。光合作用是指光合色素(主要是葉綠素)的植物細(xì)胞和細(xì)菌吸收光能，將無機(jī)物轉(zhuǎn)化為有機(jī)物并釋放出氧氣的過程。熒光是指物質(zhì)吸收光能發(fā)出的較長波長的光，它是第一單線態(tài)的葉綠素分子由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)很不穩(wěn)定，會釋放能量回到基態(tài)，這種現(xiàn)象稱熒光現(xiàn)象［16］。在正常生理溫度條件下，絕大部分植物體內(nèi)葉綠素?zé)晒鈦碜訮SⅡ的天線色素系統(tǒng)，PSⅠ色素系統(tǒng)基本不發(fā)熒光［17］。因此利用熒光儀測得的葉綠素?zé)晒鈪?shù)來研究外加氮源對葛仙米光合生理的影響。有關(guān)部門對葛仙米進(jìn)行化學(xué)成份分析，葛仙米中含有豐富的多糖及蛋白質(zhì)，據(jù)記載，葛仙米具有明目益氣、解熱清膈、利腸胃、久食延年、清除疲勞、收斂、治夜盲癥等功效［18］。據(jù)調(diào)查，鶴峰縣近年來葛仙米產(chǎn)量大大降低，其原因是:農(nóng)民不施農(nóng)家肥而改施化肥，嚴(yán)重污染了土壤，如碳銨等肥料改變了土壤的酸堿性，另外，使用除草劑也改變了葛仙米賴以生存的生長環(huán)境，因此造成了葛仙米自然資源短缺，甚至有絕跡的可能［19］。本文研究了自養(yǎng)培養(yǎng)葛仙米的最適條件，旨在通過研究，為充分開發(fā)利用和保護(hù)這一寶貴資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

葛仙米藻種由中國科學(xué)院水生生物研究所提供，原始材料采自湖北省鶴峰縣。

1.2 方法

1.2.1 藻種擴(kuò)大培養(yǎng) 每升培養(yǎng)基取2 g鮮藻種，于研缽中研磨充分，加入3 L廣口瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)基用BG110液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)15 d左右，使葛仙米生長處于對數(shù)生長期時用于實驗藻種。

1.2.2 外加氮源濃度設(shè)置及培養(yǎng) 實驗設(shè)為5個處理，分別用實驗組1～5表示，每個處理中NaNO3含量分別為 0.375、0.75、1.5(即 BG11 培養(yǎng)基)、3、6 g/L，以BG110無氮培養(yǎng)基為對照組，每組3個重復(fù)。取對數(shù)生長期的藻種對每個實驗組進(jìn)行等量接種，接種量為每升培養(yǎng)基按含300 μg葉綠素α(Chla)的標(biāo)準(zhǔn)接種。每個處理都用1 L錐形瓶，加600 mL培養(yǎng)基。實驗在光照培養(yǎng)箱中通氣培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25℃，光照強(qiáng)度50～80 μmol photos m-2/s，光周期為(14∶10)。從接種當(dāng)天開始，每隔2 d測一次葉綠素a含量及葉綠素?zé)晒鈪?shù)。

1.2.3 葉綠素 a含量的測定 參照 Scherer和Zhong(1991)的方法，將葛仙米新鮮的藻體勻漿后(如果色素能提取干凈或藻體較少可不勻漿)，加入100%甲醇，然后室溫下過夜，于665 nm處測定OD值，葉綠素a含量用以下公式計算:

A為光密度值，∈為光系數(shù)74/cm/mg mL，l為比色杯的內(nèi)徑長度1 cm。最終得出的葉綠素濃度為mg/mL。

比生長速率μ的計算公式:

其中X2、X1為2個時間點的鮮重，(T2-T1)為測定2個時間的間隔。

1.2.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定 熒光參數(shù)Fv/Fm、?PSⅡ、ETR采用英國Hansatech公司生產(chǎn)的FMS-2便攜調(diào)制式熒光儀測定。在培養(yǎng)葛仙米的錐形瓶中吸取30 mL葛仙米，抽濾后將濾紙于黑暗中放置 20 min，先照射檢測光(＜0.05 μmol/m2/s)再照射飽和脈沖光(12000 μmol/m2/s)，測定Fv/Fm后，打開內(nèi)源光化光(180 μmol/m2/s)，5 min 后測 ?PSⅡ、ETR［20］。另外每個樣品用分析天平測得藻種的鮮重。

2 結(jié)果與分析

2.1 外加氮源對葛仙米生長的影響

外加氮源對葛仙米生長的影響見表1和圖1。在培養(yǎng)過程中每隔2 d測1次葉綠素a含量，用來研究外加氮源對葛仙米生長的影響。與對照組相比實驗組外加NaNO3濃度在小于1.5 g/L時，葛仙米可以正常生長，但比對照組BG110生長較差，最大比生長率在第2天;在BG11培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d后出現(xiàn)負(fù)增長;在大于BG11即1.5 g/L NaNO3中培養(yǎng)時，第2天開始出現(xiàn)負(fù)增長，葛仙米的生長受到明顯的抑制。

表1 外加氮源對葛仙米比生長速率μ的影響Table 1 The effect of additional nitrogen on the specific rate of Nostoc sphaeroids

圖1 外加氮源對葛仙米生長的影響Fig.1 The effect of additional nitrogen on the growth of Nostoc sphaeroids

2.2 外加氮源對葛仙米光合生理的影響

2.2.1 外加氮源對葛仙米葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm的影響 外加氮源對葛仙米葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm的影響見圖2。與對照組相比，在不高于BG11(即濃度為1.5 g/L)氮濃度的培養(yǎng)下，熒光參數(shù)Fv/Fm的變化趨勢與對照組的變化趨勢相似，在前6 d中明顯下降且在第6天達(dá)到最低值，但之后又有回升，呈上升趨勢，而在BG11培養(yǎng)基的培養(yǎng)下熒光參數(shù)Fv/Fm的值一直比低于BG11培養(yǎng)基及對照組的值要高。而在高于BG11氮濃度培養(yǎng)基的培養(yǎng)下，熒光參數(shù)Fv/Fm的變化趨勢不大，隨時間延長有逐漸下降的趨勢。另外，從圖2中還可以看出，在培養(yǎng)的時間內(nèi)，在高于1.5 g/L的氮濃度培養(yǎng)下，F(xiàn)v/Fm的值明顯比其他低氮實驗組及對照組高。

2.2.2 外加氮源對葛仙米葉綠素?zé)晒鈪?shù)?PSⅡ的影響 外加氮源對葛仙米葉綠素?zé)晒鈪?shù)?PSⅡ的影響見圖3。與BG110無氮培養(yǎng)基的對照組相比，在BG11培養(yǎng)基以及低于BG11氮濃度的較低氮源的培養(yǎng)下，其熒光參數(shù)?PSⅡ的變化趨勢與對照組的變化趨勢大致相似，開始都有很明顯下降的趨勢并在第6天達(dá)到最低值，之后又有逐漸上升的趨勢;而在BG11培養(yǎng)基的培養(yǎng)下熒光參數(shù)?PSⅡ的值一直比低于BG11培養(yǎng)基及對照組的值要高。在高于BG11氮濃度培養(yǎng)基的培養(yǎng)下，熒光參數(shù)?PSⅡ開始有下降的趨勢后又有升高的趨勢，并在第4天達(dá)到最大值。另外，從圖3中還可以看出，在高于1.5 g/L的氮濃度培養(yǎng)下，?PSⅡ的值明顯比其他低氮實驗組及對照組高。

圖2 外加氮源對葛仙米葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm的影響Fig.2 The effect of additional nitrogen on fluorescence parameters Fv/Fm of chlorophyll of Nostoc sphaeroids

2.2.3 外加氮源對葛仙米葉綠素?zé)晒鈪?shù)ETR的影響 外加氮源對葛仙米葉綠素?zé)晒鈪?shù)ETR的影響見圖4。與 BG110對照組相比，在BG11培養(yǎng)基以及低于BG11氮濃度的較低氮源的培養(yǎng)下，其熒光參數(shù)ETR的變化趨勢與對照組的變化趨勢大致相似，開始都有很明顯下降的趨勢并在第6天達(dá)到最低值，之后又有逐漸上升的趨勢;而在BG11培養(yǎng)基的培養(yǎng)下熒光參數(shù)ETR的值一直比低于BG11培養(yǎng)基及對照組的值要高。在高于BG11氮濃度培養(yǎng)基的培養(yǎng)下，熒光參數(shù)ETR開始有下降的趨勢后又有升高的趨勢，并在第8天達(dá)到最大值，之后又有下降的趨勢。另外，從圖4中還可以看出，在高于1.5 g/L的氮濃度培養(yǎng)下，ETR的值明顯比其他低氮實驗組及對照組高。

圖3 外加氮源對葛仙米葉綠素?zé)晒鈪?shù)?PSⅡ的影響Fig.3 The effect of additional nitrogen on fluorescence parameters ?PSⅡ of chlorophyll of Nostoc sphaeroids

圖4 外加氮源對葛仙米葉綠素?zé)晒鈪?shù)ETR的影響Fig.4 The effect of additional nitrogen on fluorescence parameters ETR of chlorophyll of Nostoc sphaeroids

3 討論

葛仙米具有較高的食用價值和藥用價值，因此，優(yōu)化葛仙米的培養(yǎng)就具有很大的現(xiàn)實意義。氮是影響藻類生長的一個重要因素，由于葛仙米異型胞內(nèi)具有固氮酶，目前，葛仙米培養(yǎng)一般使用不含氮的BG110培養(yǎng)基培養(yǎng)，氮源是植物生長必須的營養(yǎng)素，而葛仙米盡管具有固氮作用，但是通過研究外加氮源對葛仙米生長及生理的影響，探討葛仙米的生長是否需要氮源具有一定的理論和應(yīng)用價值。

與對照組相比實驗組外加NaNO3濃度在小于1.5 g/L時，葛仙米可以正常生長，但比對照組BG110生長較差;在BG11培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d后出現(xiàn)負(fù)增長;在濃度大于BG11中培養(yǎng)時，葛仙米的生長受到明顯的抑制。一方面由于葛仙米異性胞的存在使得葛仙米生長的培養(yǎng)液中無需添加氮源，但在本實驗中添加高濃度的氮源反而抑制了其藻殖段的分裂;另一方面，氮磷的濃度比對藻體的生長會有很大的影響，氮單方面濃度的增加或許會破壞氮磷間的平衡，從而抑制了葛仙米的生長，同時，在有氮情況下，其他微生物更易繁殖，滅菌工作需更加嚴(yán)格，一些滋生的微生物會與葛仙米形成競爭，消耗培養(yǎng)基中的養(yǎng)分，影響葛仙米的生長。最后，提供的氮源—NaNO3也許不是最適合葛仙米，從目前實驗結(jié)果可以看出無氮環(huán)境是最適合葛仙米生長的環(huán)境。

植物葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)是近年來在光合作用機(jī)理研究中發(fā)展起來的一種新型、快速、簡便、精確且整體無損傷并用來檢測植物光合作用生理狀況的新技術(shù)［21］。活體狀態(tài)下，葉綠素?zé)晒鈳缀跞縼碓从赑SⅡ的Chla，活體葉綠素?zé)晒馓峁┑目焖傩畔⒎从沉薖SⅡ?qū)ぐl(fā)能的利用和耗散情況，而與光合作用過程的各個步驟密切偶聯(lián)，因此任何一步變化都會影響到PSⅡ，從而引起熒光變化，也就是說通過葉綠素?zé)晒鈳缀蹩梢蕴綔y所有光合作用過程的變化。

本實驗選擇了3個有代表性的葉綠素?zé)晒鈪?shù)來反映光合作用過程的變化。Fv/Fm:PSⅡ的最大量子產(chǎn)量，它反映了植物的潛在最大光合能力，也反映PSⅡ反應(yīng)中心最大光能轉(zhuǎn)換效率;?PSⅡ:PSⅡ?qū)嶋H電子傳遞的量子效率，不僅與碳同化有關(guān)，也與光呼吸及依賴氧氣的電子流有關(guān);ETR:光合電子傳遞效率，反映了體內(nèi)的總光合電子傳遞能力。

本實驗過程中所測得的3個葉綠素?zé)晒鈪?shù)(Fv/Fm、?PSⅡ和ETR)，在BG11培養(yǎng)基以及低于BG11氮濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，都有下降的趨勢，而BG110無氮培養(yǎng)基即對照組熒光參數(shù)值雖然低于BG11培養(yǎng)基但高于另外2個較低氮濃度培養(yǎng)基的值。而在高于BG11氮濃度的培養(yǎng)基中，上述3個熒光參數(shù)幾乎沒有下降的趨勢，這表明在這段時間里葛仙米的固氮能力還很弱，必需利用外加氮源來進(jìn)行光合作用。另一方面，在接種6～8 d之后較低氮濃度的培養(yǎng)基中葛仙米葉綠素?zé)晒鈪?shù)都有不同程度升高的趨勢，而高于BG11氮濃度的培養(yǎng)基中葉綠素?zé)晒鈪?shù)有下降的趨勢，說明在培養(yǎng)一段時間后葛仙米具有了固氮能力，不再需要外加的氮源，反而外加的氮源會抑制光合生理的過程，這可能是因為有氮的環(huán)境使其他雜菌侵入影響了葛仙米的光合作用過程。再者，在高于1.5 g/L的氮濃度培養(yǎng)下，所測3個葉綠素?zé)晒鈪?shù)值明顯比低于BG11兩個濃度組及對照組高，說明在高氮濃度下，葛仙米光合作用強(qiáng)。從目前的實驗結(jié)果可以看出，BG11培養(yǎng)基所含的氮濃度最適合葛仙米的光合生理過程。

綜上所述，無氮的BG110培養(yǎng)基最適合葛仙米的生長，而含氮1.5 g/L的BG11培養(yǎng)基葛仙米的光合生理能力最佳。另外無氮的BG110培養(yǎng)基雖然不含氮源，但其葉綠素?zé)晒鈪?shù)比另外2個較低氮濃度的實驗組的熒光參數(shù)的值要高，這可能是因為在BG110培養(yǎng)基中葛仙米的長勢最佳，而使得其光合生理的能力較強(qiáng)。

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